A型肉毒毒素辅助额部皮肤软组织扩张的生物力学研究
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[摘要]目的：通过动物实验探讨A型肉毒毒素注射后额部扩张皮瓣的生物力学性能的变化规律，以期为临床应用提供理论依据。方法：选用白色实验小型猪，在其胸腹部两侧用作网格样标记，一侧注射A型肉毒毒素，对侧注射生理盐水对照，两侧置入200ml扩张器，注水完成后切取全层扩张皮瓣作为试件，在Instron4302万能材料试验机上对皮瓣试件进行应力-应变、应力松弛和蠕变实验。结果：实验组皮瓣的粘弹性比对照组的好，更接近于未扩张皮瓣；在同样的松弛时间内，实验组皮瓣比对照组更容易松弛；在相同的应力作用下，相同的时间内，实验组皮瓣的蠕变量要小于对照组。结论：注射A型肉毒毒素后，可以使扩张皮瓣的粘弹性增强，更接近于未扩张皮瓣，扩张器注水量增加，注水间隔缩短，在相同注水量下扩张面积增加。
[关键词]A型肉毒毒素；额部皮肤软组织扩张；生物力学；应力-应变关系；应力松弛；蠕变
[中图分类号]R622 R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）02-0253-04
Study on biomechanical characteristics of using botulinum toxin A in forehead expanded flap
BAO Shi-wei1,LI Sen-kai2,HU Chun-hui3,LI Xiao-yang3
（1.Department of Plastic Surgery, Beijing Hospital,Beijing 100730, China;2.Plastic Surgery Hospital of CAMS;3.Beijing University of Technology）
Abstract: Objective Animal study is to investigate the biomechanics properties of using the botulinum toxin A to accelerate the expansion in forehead. Methods The bilateral chest and abdomen of every guinea pig was marked symmetrically in grid by tattoo. The botulinum toxin A was injected in cutaneous muscle of one side as the experimental group, the saline in other side as the control group. Implanted a 200ml expander beneath the cutaneous muscle on the bilateral chest and abdomen, and it was inflated 20ml each time, twice a week. After finished expansion, the specimens were obtained from the expanded flap and the capsule was resected. The stress-strain relationship, stress relaxation and creep of these specimens were tested by the material testing machine Instron4302. Results The viscoelasticity of the flap in the experimental group was better than the control group and similar to the unexpanded flap. In the same relaxation time,the flap in the experimental group was easy to relax than the control group. Keeping the same stress,the creep strain in the experimental group was less than the control group in the same period. Conclusion The botulinum toxin A can enhance the viscoelasticity of the expanded forehead flap,and make it similar to the unexpanded flap. It also can reduce the inflation resistance，accelerate the expansion,shorten the expansion period and enhance the area of expanded myocutaneous flap in forehead.
Key words:botulinum toxin A；expansion in forehead；biomechanics；stress-strain relationship；stress relaxation；creep
额部皮肤软组织扩张已在临床中被广泛应用，由于额部具有特殊的解剖结构，皮肤、皮下组织和额肌三层结合紧密，扩张器一般要置入到额肌下，实际上临床中常用的额部扩张皮瓣应该是一种扩张肌皮瓣[1]。笔者考虑到额部扩张时要包括额肌这一解剖特点，提出扩张器置入前使用A型肉毒毒素注射于额肌，利用其抑制突触前膜释放神经介质乙酸胆碱，阻断神经介质的传递，从而引起肌肉松弛性麻痹，肌张力减低，达到降低扩张阻力、缩短扩张时间的作用。为了进一步明确其辅助扩张效果，笔者进行了相关动物实验研究，利用皮肤生物力学特性与人相近的小型猪作为研究模型[2]，与北京工业大学机械工程与应用电子技术学院合作，采用便于临床应用的应力-应变关系、应力松弛和蠕变这三项生物力学特性进行研究，探讨A型肉毒毒素注射于额肌后，额部扩张皮瓣的生物力学特性的变化规律，为A型肉毒毒素辅助额部扩张器扩张在生物力学上寻找可靠证据，以更好的指导临床应用。
1 材料和方法
1.1 实验动物：实验动物选用中国农科院提供的白色实验小型猪4只，体重16～20，性别不限，标准饲料单笼喂养。
1.2 仪器及试剂：①A型肉毒毒素：兰州生物制品有限公司生产的衡力注射粉针（100U/支）；②扩张器：200ml长方形扩张器8枚（浙江余姚久盛硅橡胶制品厂）；③文身机、文刺针及红色文身颜料；④Stimuplex HNS 11神经刺激仪(德国Stockert GmbH公司)；⑤Instron4302万能材料试验机（制造商是英国Instron Ltd公司）；⑥实验用物：速眠新、氯胺酮、陆醒灵及利多卡因；⑦常规手术器械；⑧注射器、4-1/2头皮针、钢尺。
1.3 实验方法
1.3.1 麻醉
采用氯胺酮和速眠新按2:1或3:1混合后肌注全身麻醉，药物用量为首次肌注0.2ml/kg，手术时间每超过1.5h追加半量，术中使用1%的利多卡因行局部浸润麻醉。
1.3.2 文身：距背正中线相等的胸腹部两侧，用文身机作长方形网格样标记，大小为10×6,网格间距为2，长轴与猪脊柱垂直（即与猪皮肌纤维垂直），用红色颜料标记。
1.3.3 A型肉毒毒素注射：随机选取小型猪一侧胸腹部红色文身区（即扩张器拟植入区）注射A型肉毒毒素，对侧注射生理盐水作为对照组。利用神经刺激仪指示注射深度。A型肉毒毒素的用法为：用4ml生理盐水溶解100uA型肉毒毒素，浓度为2.5U/0.1ml，每点注射2.5U/0.1ml，总量60U。
1.3.4 扩张器植入：3天后行扩张器植入术，左右两侧均植入200ml长方形扩张器各一枚：在红色文身区头侧或尾侧切开皮肤，切口长约3cm，在皮肌下作钝性分离，分离腔隙至红色文身区边缘，切勿超过红色文身区，将扩张器植入皮肌下。分层缝合切口，术后肌注青霉素80万单位，用磺胺喂养3天，预防切口感染。
1.3.5扩张器注水：扩张器植入术后7天开始向扩张器内注水，每次扩张器固定注水量20ml（扩张器容量的10%）,注水总量达到扩张器额定容量200ml时完成扩张过程。
1.3.6 生物力学实验试件的切取：扩张器注水完成后7天，在每个扩张皮瓣中央上下两侧，平行于脊椎方向切取3条2×1全层扩张皮瓣，修剪掉包膜组织。即每只小型猪实验侧切取6个试件，对照侧切取6个试件，共12个试件。切取皮瓣的方向要与皮肌纤维的方向保持一致，并以其长轴方向进行生物力学检测，以消除因肌纤维方向而造成扩张皮瓣生物力学特性的各异所带来的偏差。
1.3.7 生物力学检测：与北京工业大学机械工程与应用电子技术学院合作，在Instron4302万能材料试验机上对皮瓣试件进行应力-应变、应力松弛和蠕变实验。实验在常温下进行，且用超声波加湿器保持一定的湿度。本实验采用的传感器为100N，变形由Instron4302万能材料试验机自动测量，所有的力学实验都经过预调处理过程。先对试件进行抗拉强度实验，然后根据强度实验的结果定出合理的应力水平，在同一应力水平下进行其它的生物力学实验。测定应力-应变时以相同的速度10mm/min拉伸试件，直到载荷达到约2.0MPa，然后以同样速度卸载，直到载荷为0，经过三次这样的加载和卸载处理后，可以看到加载和卸载时的应力-应变曲线的滞后环相对消失，曲线趋于稳定，此时的应力-应变为经过预调处理的结果，取实验的第4次结果，进行比较和计算。对应力松弛和蠕变也同样要经过预调，使其达到稳定状态。进行应力松弛实验时，本实验中设定加载速度为125mm/min，使试件突然受拉至某一应力水平约2.0MPa，并保持其伸长不变，应力将会逐渐减小，松弛时间为600s。进行蠕变实验时，加载速度为10mm/min，试件达到应力约为2.0MPa时，保持应力不变，试件将变形发生蠕变，本实验中蠕变时间为600s。
1.3.8 统计学处理：将A型肉毒毒素注射侧的扩张皮瓣试件与对照侧试件做对比，研究A型肉毒毒素注射后扩张皮瓣的生物力学特性的变化情况。所有数据均采用origin7.5进行拟和比较，得出其拟合参数，再进行t检验，来分析比较两种材料各个性能的差别。
2 结果
2.1 应力-应变：经过三次加载卸载处理后，曲线趋于稳定，此时实验的第4次结果应力-应变为经过预调处理的结果，记录此时试件上的拉力F和伸长量 L。因为扩张皮瓣为软组织，要按大变形计算，因此采用大变形的应力-应变关系。分别计算伸长比λ=。假定皮肤为不可压缩材料，采用Lagrange应力 和Green应变，其中lagrange应力为T=F/A0,Green应变ε=（λ2-1）/2，其中F为作用于试件上的拉力，A0为初始面积，L为试件伸长后长度，L0为试件的初始长度。
实验组和对照组的应力-应变曲线见图1。由图1的两组试件的应变通过函数 拟合所得的参数值见表1。
以上的应力应变曲线反映了扩张皮瓣在不同应力作用下组织的变形能力，是生物软组织粘弹性指标之一。同样的应力作用下，变形越大，表明其粘弹性越大。从图1中的曲线变化趋势可以看出在同一应力水平下实验组应变大，说明实验组皮瓣的粘弹性比对照组的好，更接近于未扩张皮瓣。经统计分析，二者之间有显著性差异（P
2.2 应力松弛：将试件突然施加一100N定力，使其有一定的伸长量，然后保持此伸长量不变，试件内相应的应力逐渐减小的过程，称为应力松弛。松弛实验也需要经过预调整，使其达到稳定状态。为了使不同的应力状态有统一的描述，将松弛曲线进行归一化处理，即把所有应力值除以最初应力值(t=0时的应力值)。图2为实验组和对照组的归一化应力松弛曲线G（t）。由图2的归一化松弛曲线通过函数 进行拟合比较所得的各参数值列于表2。
从以上应力松弛曲线图可以看出，在同一应力水平下，保持试件长度不变时，对照组的应力减小量小于实验组，也就是说，在同样的松弛时间内，实验组皮瓣比对照组更容易松弛。经统计分析，两试件的松弛量有显著性差异（P
由图中可以看出对照组的 曲线低于实验组的 曲线，蠕变和松弛同属于软组织粘弹性性质，但它们的力学特性由不同的表现和反映，参数Je可以用来反映试件的蠕变实验期终止时的J(t)值，Je反映了蠕变的程度。从图中可以看出，蠕变终止时，对照组的Je值最小。说明在相同的应力作用下，相同的时间内，对照组的蠕变量小，就是说实验组皮瓣的蠕变量要好于对照组。经统计分析，实验组的蠕变量和对照组的蠕变量有显著性差异（P
3 讨论
自1976年Radovan[3]设计出硅胶囊扩张器以来，额部软组织扩张已在临床中被广泛应用于头面部外伤、瘢痕、肿瘤及先天畸形等的治疗，对头面部器官的再造由于其具有皮肤色泽相近、就近转移、血运丰富等优点而被优先选用，额部皮肤扩张已成为部分或者全鼻再造的首选方法。但是，常规皮肤扩张术治疗周期长仍是目前困扰临床的突出问题。在额部，由于特殊的解剖层次，扩张器一般要置于额肌下，这就使得额部扩张器在注水扩张的过程中不仅要克服表面皮肤的阻力，而且要受到额肌的限制，使扩张器注水速度减慢，注水期延长。基于以上原因和额部的特殊解剖结构，笔者提出在额部扩张器置入前注射A型肉毒毒素于额肌，利用A型肉毒毒素抑制突触前膜释放神经介质乙酸胆碱，阻断神经介质的传递，从而引起额肌松弛性麻痹，使肌肉松弛，肌张力减低，达到降低扩张阻力、缩短扩张时间的作用。由此笔者进行了相关的动物实验及临床研究[4-5]。为了进一步明确其辅助扩张效果，为A型肉毒毒素辅助额部扩张器扩张在生物力学上寻找可靠证据，笔者与北京工业大学机械工程与应用电子技术学院合作，采用便于临床应用的应力-应变关系、应力松弛和蠕变这三项生物力学特性进行研究，探讨A型肉毒毒素注射于额肌后，额部扩张皮瓣的生物力学特性的变化规律，以更好的指导临床应用。
软组织力学是通过离体及活体的实验来研究生物材料的力学性能。近20年来，软组织力学研究被大量的应用于软组织扩张的基础研究，皮肤软组织经扩张器扩张后之所以能够延伸增加其面积，主要由其生物力学性质决定的，很多学者对皮肤扩张后的生物力学特性进行了研究，取得了肯定的研究结果[6-8]。
由于皮肤的力学性能在不同个体的同一部位存在差异，在同一个体的不同部位也存在差异，同一皮肤在不同方向上的性能不完全相同，任何部位的皮肤还会随年龄增长发生显著的变化[9]；而且由于要与皮肌一同扩张，皮肌的肌纤维方向不同，其力学性能也各不相同。因此，笔者采用对照实验的研究方法，即选用小型猪距脊柱两侧相同的胸腹部植入扩张器，标本切取时方向保持一致以避免因猪皮肤生物力学特性各向异性所产生的实验误差，并统一选取皮瓣平行于皮肌肌纤维方向进行生物力学检测，力求尽量消除可能引起对照差别的各种主要因素，使实验结果更加可靠。
皮肤软组织的应力-应变关系反映皮肤在不同应力的作用下组织变形的能力，是代表皮肤粘弹性的指标之一。它不服从虎克定律，应力随着应变的增加比虎克定律预计的要快得多，是非线性的关系，这是由皮肤的各向异性造成的[2]。在同样的应力作用下，变形越大，表明其粘弹性越强[10]。从实验结果看，注射A型肉毒毒素后，实验组扩张皮瓣的应变增大，其粘弹性增强，性质更接近于未扩张皮瓣。
皮肤的应力松弛特性是指在维持组织应变不变的情况下，应力随时间而下降的特性。皮肤经扩张后即产生组织的变形，面积增加，扩张器表面的张力（相当于初始应力）增大。以后随着时间的增加，皮肤逐渐变得松弛，应力逐渐下降，应力松弛特性的存在允许皮肤能进行下一次的注水。实验结果反应的注射A型肉毒毒素后皮瓣的应力松弛要优于对照组，表明在同样的松弛时间内,实验组比对照组松弛的更为充分，说明在相同的间隔时间下，实验组能耐受更大的注水量，或者能够在更短的间隔时间内进行下次注水。
蠕变则是指给予皮肤一定的应力，并保持不变，皮肤可随时间的增加而逐渐被拉长。Gibson[11]将蠕变分为机械性蠕变和生物学蠕变。后者伴有代谢的增加及组织增殖，故皮肤的扩张属于生物学蠕变。由于具有蠕变特性，所以皮肤在扩张器注水扩张时能被逐渐扩张。从实验结果看，实验组的蠕变性能大于对照组，说明在同样应力作用同样时间的情况下，实验组皮瓣较对照组蠕变速度快，蠕变量大，反应了在相同的注水张力下，注射A型肉毒毒素后可使皮瓣的机械蠕变更大，得到更多的扩张面积。
4 结论
应用实验动物对A型肉毒毒素注射于额肌后额部皮瓣的生物力学性能进行评价，可以得出结论：注射A型肉毒毒素后，可以使扩张皮瓣的粘弹性增强，更接近于未扩张皮瓣，扩张器注水量增加，注水间隔缩短，在相同注水量下扩张面积增加。这一结果与动物实验结果相互印证，为临床应用提供了可靠的理论基础。
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[收稿日期]2011-10-13 [修回日期]2011-12-18