鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶的分离纯化和性质研究
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摘要：目的从鲜地黄分离纯化β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶，并研究其性质。方法通过磷酸盐缓冲液提取、两步硫酸铵盐析和两步凝胶柱层析，分离纯化鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶。以pNPG为底物，研究两种酶的最适反应温度及温度稳定性。结果与结论从鲜地黄中分离得到1种β-葡糖苷酶和3种α-半乳糖苷酶同工酶。研究发现β-葡糖苷酶热稳定性较差，在50 ℃即迅速失活；而α-半乳糖苷酶在50 ℃总酶活性最高，热稳定性较好，70 ℃以上时活性迅速下降。
中图分类号：R282.71文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)11-0012-04
Separation, Purification and Property Study of β- Glucosidase and α- Galactosidase from Fresh Roots of Rehmannia glutinosa
ZHAO Yu, WEN Xue-sen, CUI Jing, WU Wei-hong
(Institute of Pharmacognosy, School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China)
Abstract：Objective To separate and purify β-glucosidase and α-galactosidase from the fresh roots of Rehmannia glutinosa, and study the properties of them. Methods β-glucosidase and α-galactosidase were extracted from the fresh roots with phosphate buffer and preliminarily purified by two-step salting out with ammonium sulfate and two-step gel column chromatography. The optimal activity and thermal stability of the two enzymes were studied with pNPG as a substrate.Results and Conclusion In the fresh roots of Rehmannia glutinosa, β-glucosidase was composed of only one ingredient, while α-galactosidase was composed of three isozymes. β-glucosidase had a poor thermal stability and it was inactivated rapidly at 50 ℃, while α-galactosidase got the highest total activity at 50 ℃ and lost its activity at the temperature over 70 ℃ for a short time.
Key words：Rehmannia glutinosa; β-glucosidase; α-galactosidase; purification; property
地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）为玄参科多年生植物，其块根以鲜地黄、生地黄和熟地黄等形式入药。由于鲜地黄不易保存，入药以生地和熟地为主。梓醇为鲜地黄的主要有效成分，现已证明，它具有降血糖、缓泻[1]、滋阴[2]、抗炎[3]和抗肝炎病毒[4]等多种生物活性。水苏糖也是鲜地黄的主要成分，在加工过程中它可能生成半乳糖[5]，半乳糖有诱导衰老的作用[6]，可能是地黄中的有害成分。在加工成生地后，梓醇和水苏糖含量均显著下降，导致这种变化的原因可能是鲜地黄产后的加工方法。目前，鲜地黄多采用烘干干燥，文献记载的烘干工艺有较大差异，主要差别是加热温度的控制。干燥模式不同导致了成品药材品质差别较大。
我们通过前期研究证明，鲜地黄中有β-葡糖苷酶（β-Glu）和α-半乳糖苷酶（α-Gal），这两种酶在鲜地黄的产后加工过程中可能导致有效成分梓醇的分解和有害成分半乳糖生成。鲜地黄产后加工的机制可能是加热使这两种酶灭活，从而避免梓醇分解和半乳糖生成；同时，烘干温度控制在一定范围内是为了避免梓醇等有效成分的热分解。我们围绕这一假说对鲜地黄中两种酶进行了分离纯化，并初步研究了两者的性质，为进一步探索其在鲜地黄加热烘焙过程中的变化及作用奠定了基础。
1材料和方法
1.1材料与试剂
鲜地黄，2004年10月采挖于山东菏泽，经鉴定为玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）植物Rehmannia glutinosa Libosch.，为栽培品种“831”。
对硝基苯基-β-D-葡萄吡喃糖苷（pNPG-β）、对硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷（pNPG-α,Sigma）；牛血清白蛋白（Amresco）；层析介质DEAE Sepharose Fast Flow、Sephadex G-25、Sephadex G-100（Pharmacia）。其他试剂为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1β-Glu和α-Gal的分离纯化将鲜地黄切成小块，加入3倍量4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液，匀浆，于4 ℃提取4 h。提取液12 000 r・min-1低温离心20 min，取上清作为粗酶液，经30 %和60 %两步硫酸铵盐析，得初步纯化的酶液[7]。经Sephadex G-25凝胶柱脱盐，合并含两种酶的部分，经固体蔗糖反透析浓缩至较小体积，上Sephadex G-100凝胶柱（1.6 cm×50 cm，），用0.02 mol・L-1 NH4Ac溶液洗脱，流速0.5 mL・min-1。洗脱液每3 mL收1份，280 nm紫外检测结合酶活性测试。分别合并收集酶纯度较高的部分，测定总酶活性、总蛋白性，计算比活。
经过Sephadex G-100凝胶层析的洗脱液，合并第一峰部分，经固体蔗糖反透析浓缩至较小体积，上DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱（1.6 cm×30 cm），先用0.03 mol・L-1 pH 6.0磷酸盐缓冲液1倍体积洗脱，然后接入梯度混合器，以0.03 mol・L-1磷酸盐缓冲液为基本缓冲液，0～0.8 mol・L-1 NaCl进行线性梯度洗脱，流速1 mL・min-1。洗脱液每3 mL收1份，280 nm紫外检测结合酶活性测试，确定两种酶的位置。分别合并收集酶纯度较高部分，测定总酶活性、总蛋白质，计算比活[8]。
1.2.2β-Glu和α-Gal性质的初步研究研究经上述方法从鲜地黄所得初步纯化酶液的最适反应温度。以5 mmol・L-1 pNPG为底物，反应pH6.0，设定反应温度范围为40～90 ℃，每隔5 ℃为一温度点，反应10 min，测定酶活性。比较不同反应温度条件下酶活性的大小，分别得两种酶的最适反应温度。
将初步纯化的酶液分为5组，分别置于50～90 ℃水浴中保温，设定温度间隔为10 ℃。分别在0，5，15，30 min和1.0，2.0，4.0，8.0，12.0 h取出酶液，按酶活性测定方法以5 mmol・L-1 pNPG为底物测定酶活性。绘制不同温度下两种酶的温度稳定性曲线，总结其温度稳定性的规律。
2结果与讨论
2.1柱层析纯化β-Glu和α-Gal
经提取和两步盐析的混合酶液过Sephadex G-100凝胶柱层析，结果见图1。
经Sephadex G-100凝胶柱层析，α-Gal出现2个活性高峰，表明α-Gal至少有2个同工酶（α-GaL-1，α-Gal-2），它们之间相对分子质量相差较大。β-Glu仅出现一个活性高峰，分子大小与α-Gal第一个同工酶（α-GaL-1）接近。
由于α-Gal第一个同工酶（α-GaL-1）与β-Glu均处于凝胶柱层析的溶剂前沿位置，所含杂蛋白质较多，故合并收集Sephadex G-100凝胶柱层析洗脱液的第一个蛋白质峰，进一步过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱纯化，见图2。
由图2可见，先以0.03 mol・L-1磷酸盐缓冲液洗脱，出现β-Glu和α-Gal的1个同工酶（α-GaL-1-1），当增加NaCl梯度至约0.1 mol・L-1时，又出现α-Gal的1个同工酶（α-GaL-1-2），由此推知，α-Gal至少应有3个同工酶（α-GaL-1-1，α-GaL-1-2，α-Gal-2）。而β-Glu仅出现一个活性高峰，仍与α-GaL-1-1部分重合。
鲜地黄经过溶剂提取、两步盐析和两步柱层析后，β-Glu和α-Gal均得到纯化，其纯化过程见表1和表2。
由表1、2可知，经溶剂提取、两步盐析和两步柱层析后，鲜地黄中β-Glu较原药材纯化了5.2倍，α-Gal的3种同工酶（α-GaL-1-1，α-GaL-1-2，α-Gal-2）较原药材分别纯化了2.7、2.3和2.1倍。
2.2β-Glu和α-Gal性质的研究
2.2.1最适反应温度由于α-Gal有3种同工酶，我们用3者的混合物研究其性质，故以下研究提及的α-Gal均为α-Gal总活性，记为总α-Gal。
酶液通过不同温度下测试酶活性，得到两种酶在不同温度下活性的变化，见表3，酶活性均以吸光度值表示。
由表3的数据可知，pH 6.0，底物pNPG浓度5 mmol・L-1条件下，总α-Gal活性在50 ℃时最高，可认为总α-Gal的最适反应温度为50 ℃。由于β-Glu活性变化在测试范围内始终呈下降趋势，故未得到β-Glu的最适反应温度，可能是β-Glu热稳定性较差，随测试温度逐渐升高，酶快速失活，酶反应速度小于酶失活速度所致。进一步对两种酶的温度稳定性进行实验即可证实。
2.2.2温度稳定性规律混合酶液在不同温度下保温不同时间后，测试酶活性，得两种酶的温度稳定性，结果见表4和表5，酶活性均以吸光度值表示。
由表4可知，β-Glu温度稳定性较差，50 ℃条件下，加热5 min酶活性即下降至不足原来的1/4，加热30 min即失去活性。温度升高到60 ℃以上时，加热5 min，酶即灭活。
由表5数据可知，总α-Gal在50 ℃时，热稳定性较好，加热30 min之内，活性下降不大，加热12 h后仍有微弱活性。温度升到60 ℃以上时，酶活性急剧下降，70 ℃加热15 min，酶即灭活。
3小结
通过溶剂提取、两步盐析和两步柱层析，首次从鲜地黄中纯化得到β-Glu和α-Gal。研究了两者的温度稳定性规律。今后将继续探索两者在地黄加热烘焙过程中的作用，结合两种酶的变化与鲜地黄加工过程中主要有效成分梓醇和水苏糖变化的关系，揭示鲜地黄产后的加工机制。
参考文献
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