高效液相色谱法测定珠毛蟹甲草中木犀草素的含量

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摘 要：为建立高效液相色谱法测定珠毛蟹甲草中木犀草素含量的方法，采用zorbaxSB-C18 色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇：水（0.04% H3PO4）=45：55，流速为1.0mL・min-1，检测波长360nm，柱温30℃。木犀草素在0.011～0.176μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=702.5X-68.42（r=0.9998），平均回收率可达100.91%，RSD=2.47%。本方法方便、准确，可以用于珠毛蟹甲草药材的质量控制。

关键词：高效液相色谱法；珠毛蟹甲草；木犀草素

中图分类号：R284 文献标识码：A

珠毛蟹甲草（Parasenecio roborowskii）为菊科千里光族中款冬亚族蟹甲草属植物，多年生草本， 生于山谷沟边、林下或灌丛中，分布于青海、甘肃、四川等省[1]。该属植物用于传统中医中药治疗，并具有抗氧化、抗辐射和抗组胺活性[2]的成分，具有顺气化痰、止咳、泻下等功效。珠毛蟹甲草在藏药上全草入药，有治疗哮喘等疾病之[3]功效。其中所含有的木犀草素在国内外对其开发研究非常活跃，主要集中对人体黑素瘤细胞的保护作用、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肝细胞生长因子等方面[4]。为有效控制珠毛蟹甲草药材的质量，现用HPLC初步建立一种稳定、可靠的检测其中木犀草素含量的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与药材

高效液相色谱仪（Agilent 1200），包括四元泵，DAD检测器（美国Agilent公司），微量进样器（30?L定量管）；kQ3200B型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），AL204型电子天平（梅特勒 -托利多仪器上海有限公司）。

珠毛蟹甲草药材于2009年7月采自青海互助北山林场，由中国科学院西北高原生物研究所研究员孙洪发研究员鉴定，样品阴干后粉碎过80目筛，冷藏保存。木犀草素对照品购自中国药品生物制品检定所（批号 111520- 200201）。甲醇为色谱纯；磷酸为分析纯；水为新制纯化水。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件

色谱柱为zorbaxSB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相采用甲醇-水（0.04%H3PO4）进行洗脱，体积比为45∶55；流速1.0mL/min；检测波长360nm；柱温30℃；进样量10?L。该色谱条件下，木犀草素与其他色谱峰达到基线分离，见图1。

（a）

（b）

图1 对照品和样品溶液的色谱图

1.2.2 对照品储备溶液的制备

精密称取木犀草素对照品11.0mg置50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得浓度为0.22mg/mL对照品储备液。

1.2.3 供试品溶液的制备

精密称取珠毛蟹甲草药材粉末0.5g，置50mL烧瓶中，加甲醇15mL，超声35min，同条件提取3次，合并滤液，于50mL容量瓶中定容，过微孔滤膜（0.45μm），作为测定珠毛蟹甲草中木犀草素的供试品溶液。

1.2.4 线性关系考查

精密量取对照品储备5uL、10uL、40uL、60uL、80uL置1.0mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成系列浓度的对照品溶液，取10μL进样后记录峰面积，以样品积分峰面积（Y）对进样量（X）线性回归，回归方程为Y=702.5X-68.42，r=0.9998（n=5），线性范围为0.011～0.176μg。

1.2.5 精密度试验

精密称取0.5g样品，按“1.2.3”项操作。按“1.2.1”项色谱条件下重复进样5次，测定5次木犀草素色谱峰的峰面积，计算得RSD=1.4%（n=5），表明仪器精密度良好。

1.2.6 重复性试验

精密称取5份0.5g样品，按“1.2.3”项操作。测定出5份样品中木犀草素的含量，计算得RSD=1.6%（n=5），表明方法重现性较好。

1.2.7 稳定性试验

精密吸取上述供试品溶液，在0h、4h、8h、12h、24h，分别进样5μL，测定每次进样后木犀草素的峰面积，计算得RSD=1.3%（n=5），说明样品在24h内稳定。

1.2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品9份各约2g，分别精密加入样品浓度的75%、100%、125%等3个含量的木犀草素对照品，每个含量平行做3份，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，进样测定，计算得平均回收率为和RSD分别为100.91%、2.47 %（n=9）。

1.2.9 样品含量测定

用“1.2.2”和“1.2.3”项下制备的供试品溶液，分别在“1.2.1”项色谱条件下进样。用外标法计算珠毛蟹甲草中木犀草素平均含量为7.926mg/g，RSD为0.92%（n=5）。

2 讨论

2.1 提取条件的选择

曾考察了水冷浸、75%乙醇回流提取和甲醇超声的提取效率，结果证明甲醇提取效率最高；提取时间不宜太短，否则提取不完全，也不应太长，且会破坏木犀草素的结构。提取时间为35min时提取较完全。

2.2 检测波长的选择

通过DAD检测器在200～400nm进行扫描，木犀草素的最大吸收波长在360nm，固本实验选取360nm作为检测波长；流动相中加入0.04%磷酸以抑制色谱峰拖尾，本实验选定甲醇-水（0.04%磷酸）（45∶55）为流动相，改善了木犀草素拖尾的状况，且能与其他峰达到基线分离。从测定结果来看，可以用于珠毛蟹甲草药材质量的控制。

参考文献

[1] 中国科学院西北高原生物研究所.青海经济植物志[M].西宁：青海人民出版社，1987：602-603.

[2] Yue M E，Jiang T F，Liu X，et al. Separation and Determination of Coumarins from Cacalia tangutica byCapillary Zone Electrophoresis[J].Biomedical Chromatography，2005，19：250-254.

[3]郭本兆.青海经济植物志[M].西宁：青海人民科学出版社，1987：191.

[4]任鹏.木犀草素抑制肝癌SMMC7721细胞增殖的研究[J].生物技术通讯，2007，18（5）：798-799.

作者简介：张海霞（1989-），女，汉族，甘肃省金昌市金川区，硕士研究生二年级在读，藏药质量控制；卢永昌（1968-），男，汉族，陕西蓝田，教授，研究方向：中藏药质量标准研究。