限制性核酸内切酶的试题解题指导

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结合近几年的高考试题可发现对基因工程考查包括：DNA重组技术的基本工具及其使用，目的基因的获取与扩增，基因表达载体的构建，基因进入受体细胞的载体与途径，目的基因表达与检测、蛋白质工程的原理等。其中涉及限制性核酸内切酶相关的试题最多。结合相关试题总结如下。

■ 一、 限制性核酸内切酶的来源和特点及与其他酶的区别

限制性核酸内切酶是从原核生物中分离出来的一种酶，能识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列，把每一条链定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键打开。使用限制性内切酶的目的就是获取目的基因，它受温度、pH等影响。DNA连接酶则是把有黏性末端的2条能碱基互补配对的DNA链连接起来，主要是相邻的磷酸与脱氧核糖核酸形成磷酸二酯键。DNA聚合酶则是将单个核苷酸与DNA单链通过磷酸二酯键连接起来。解旋酶则打开DNA双链之间的氢键。

■ 例1 下列关于限制性核酸内切酶的说法中，不正确的是（ ）

A. 限制性核酸内切酶广泛存在于各种生物中，一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列

Ｂ. 限制性核酸内切酶将一个ＤＮＡ分子片段切成两个需要消耗两个水分子

Ｃ. Ｔａｑ酶是用ＰＣＲ仪对ＤＮＡ分子扩增过程常用的一种耐高温的ＤＮＡ聚合酶

D. 限制性核酸内切酶的作用主要是用来提取目的基因

■ 解析 限制性核酸内切酶主要是从原核生物中分离出来的，并不是广泛存在于各种生物中。一种限制性核酸内切酶能识别双链DNA的某种特定的核苷酸序列，并且是每一条链定部位的两个核苷酸之间磷酸二酯键断开；ＤＮＡ是双螺旋结构，水解时需要两个水分子；Ｔａｑ酶就是一种耐高温的聚合酶；利用限制性核酸内切酶的目的就是为了获取重组ＤＮＡ。

■ 答案 Ａ

■ 二、 限制性核酸内切酶作用位置不一样

一种限制性核酸内切酶识别双链DNA的某种特定的核苷酸序列，并且是每一条链定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。不同的限制性核酸内切酶对同一DNA进行切割，切割的位置就不同，同时切割时，就可能产生多个DN段。高考时常会要求考生判断限制性核酸内切酶的具置或限制性核酸内切酶切割DNA所得片段计算。

■ 例2 现以3种不同的限制性核酸内切酶对6.2 bp大小的线性DNA分子进行剪切后，用凝胶电泳分离各核酸片段，实验结果如下图。则3种不同的限制性核酸内切酶在此DN段上相应切点的位置是（ ）

■ 解析 根据表格可知A酶有2个切点、B酶有1个切点、C酶有2个切点。B、C两选项中B酶有两个切点，是错误的；A选项A酶切割形成的片段分别是0.3+0.7、2.6+0.9、0.5+1.2不符合要求；D选项A酶切割形成的片段分别是0.3、0.7+2.6+0.9、0.5+1.2符合要求。

■ 答案 D

■ 例3 一环状DNA分子，设其长度为1，已知某种限制性核酸内切酶在该分子上有3个酶切点，如右图中A、B、C三处。如果该DNA分子在3个酶切点上都被该酶切断，则会产生0.2、0.3、0、5三种不同长度的DAN片段。现有多个上述DNA分子，如在每个分子上至少有1个酶切点被该酶切断；则从理论上讲，经该酶切后，这些DNA分子最多能产生长度不同的线状DNA的种类数是（ ）

A. 5 B. 6

C. 7 D. 8

■ 解析 根据题干信息的分析：若只有一个酶切点被该酶切断，就可能得到一种长度的DN断；若用2个酶来切割，则可出现0.3、0.7、0.2、0.8、0.5、0.5六种情况，就有五种不同长度的DN断；若用3种酶同时切割，则形成0.3、0.5、0.2三种片断，与上述形成重复片断，这样总计有6个不同的片断。

■ 答案 B

■ 三、 灵活掌握重组DNA的构建

重组DNA的构建涉及到限制性核酸内切酶的正确选取和载体的选择等，具体操作复杂，涉及的题型主要包括以下几个方面。

（1） 选择合适的限制性核酸内切酶，保证目的基因和有关抗性基因的完整性。

■ 例4 下图表示利用基因工程培育抗虫棉的过程，请据图回答下列有关问题：

若限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是―GATC―，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是―GGATCC―，那么在①过程中，应用限制性核酸内切酶_________切割质粒，用限制性核酸内切酶_________切割抗虫基因。①过程在_________（体内/体外）进行。

■ 解析 由限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点可知，限制性核酸内切酶Ⅰ可以识别并切割限制性核酸内切酶Ⅱ的位点，而限制性核酸内切酶Ⅱ则不能识别并切割限制性核酸内切酶Ⅰ的位点。故质粒用限制性核酸内切酶Ⅱ切割，保留四环素抗性基因，目的基因用限制性核酸内切酶Ⅰ（或限制性核酸内切酶Ⅰ和Ⅱ）切割。①为构建基因载体的过程，该过程在体外进行；大肠杆菌导入重组质粒后，含有正常的四环素抗性基因。

■ 答案 Ⅱ Ⅰ（Ⅰ和Ⅱ） 体外

（2） 明确切割目的基因和质粒时，一般用到两种限制性核酸内切酶。

（3） 涉及多种限制性核酸内切酶同时作用。