补肾复方对压力负荷增加大鼠心肌纤维化的影响

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇补肾复方对压力负荷增加大鼠心肌纤维化的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘 要:目的:观察补肾复方逆转压力负荷增加大鼠心肌纤维化的作用。方法:采用腹主动脉狭窄所致压力负荷增加大鼠左室重构模型,将雄性SD大鼠60只随机分为假手术组、模型组、卡托普利组、补肾复方大剂量组、补肾复方小剂量组,观察用药4周后左室心肌病理形态胶原染色、左室心肌间质超微结构、左室心肌Ⅰ型胶原免疫组织化学染色、左室心肌Ⅲ型胶原免疫组织化学染色等指标的改变。结果:模型组Ⅰ型胶原的平均光密度与假手术组比显著升高(P

关键词:心肌纤维化;压力负荷;Ⅰ型和Ⅲ型胶原;补肾复方

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0677-05

Study on Regressing Myocardial Fibrosis in Rat with Pressure

Overload by Bu Shen Prescription

CAI Hui, ZHANG Qunyan, DONG Xiaolei,ZHAO Zhiming,GUO Junhao,SHANG Wei

(Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command, PLA, Nanjing 210002, Jiangsu)

Abstract:Objective:To observe the effects of Bu Shen Prescription on regressing myocardial fibrosis in rat with pressure overload. Methods:The model of left ventricular remodeling in rat with pressure overload by abdominal aortic constriction was used. 60 SD male rats were randomly divided into five groups: sham operation group, model group, captopril group, Bu Shen Prescription high dosage group and low dosage group. After treatment 4 weeks, it was observed that the changes of left ventricular myocardium collagen pathological coloring, left ventricular interstitial cardiac tissue ultramicrostructure, left ventricular cardiac tissue collagen type Ⅰimmunohistochemistry coloring and collagen type Ⅲ immunohistochemistry coloring. Results: The average optic density of left ventricular cardiac tissue type Ⅰcollagen and type Ⅲ collagen of model group were increased obviously than that of sham operation group (P

Key words:myocardial fibrosis; pressure overload; collagen type Ⅰand Ⅲ; Bu Shen Prescription

收稿日期:2009-12-01

基金项目:南京总医院科研基金资助项目(Q2008042)

作者简介:蔡辉(1959-),男,江苏启东人,主任医师、教授,博士研究生导师,中医学内科学博士,中西医结合博士后,主要从事中西医结合基础与临床研究。

心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)往往被看成是各种心肌损害的被动结局,可引起心功能障碍,心律失常,甚至猝死,是心血管疾病的主要死亡原因之一。有研究表明,心肌胶原基质内主要结构蛋白为Ⅰ型和Ⅲ型胶原,心肌纤维化较左室重量(LVM)更能反映心脏的舒张功能[1]。从某种意义上,心肌纤维化就是心肌胶原基质内Ⅰ型和Ⅲ型胶原网络的重构。因此,逆转MF和减轻心室重构已成为治疗心血管病的重要目标。本研究主要以心肌间质超微结构及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色为指标,观察补肾复方对压力负荷增加大鼠心肌纤维化的逆转作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

动物:雄性SD大鼠60只,体重180～200g。药物:卡托普利,12.5mg/片,中美上海施贵宝制药有限公司生产,批号9912031J。补肾复方口服液,由淫羊藿、熟地、肉苁蓉、益母草、葶苈子、徐长卿、沉香、川芎等组成纯中药复方,生药含量1.6g/mL。

1.2 造模方法

参考Doering等[2]的方法,2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉,固定,剃毛,常规消毒,分层打开腹腔,在左肾上缘分开后腹膜等软组织,暴露腹主动脉,并在双肾动脉上方分离腹主动脉,用银夹造成腹主动脉狭窄(银夹内径0.7mm),分层关闭腹腔。

1.3 分组处理

随机分为5组,所有动物均常规喂养。假手术组(12只):手术时只分离腹主动脉,不用银夹缩窄,手术4周后,双蒸水灌胃1.5mL/100g体重,1次/日,连续4周。模型组(12只):造模4周后,双蒸水灌胃1.5mL/100g体重,1次/日,连续4周。卡托普利组(12只):造模4周后,卡托普利灌胃100mg/kg(相当于成人80～160倍),1次/日,双蒸水稀释,连续4周。补肾复方大剂量组(12只):造模4周后,补肾复方口服液(生药含量24g/kg体重,相当于成人16倍),1次/日,灌胃,连续4周。补肾复方小剂量组(12只):造模4周后,补肾复方口服液(生药含量12g/kg体重,相当于成人8倍),1次/日,灌胃,连续4周。

1.4 观察指标

1.4.1 左室重量指数(LVMI) 迅速取出心脏,沿房室交界处去除左右心房及大血管,去除右心室游离壁,将左心室加室间隔用JA1003型电子天平准确称重(上海精科天平厂生产的)作为LVM,并计算按照左室重量(mg)/体重(g)公式即左室重量指数(‰)作为左室肥厚的指标。

1.4.2 左室心肌病理形态胶原染色 试剂配制:Ponceau's染色液400mL(0.5% Ponceau's水溶液40mL,苦味酸饱和水溶液360mL);Victoria blue'B染色液400mL(Victoria blue'B2.0g,70%乙醇400mL)。染色方法:组织切片脱蜡至水;70%乙醇稍洗后,入Victoria blue'B染色液中15min;95%乙醇中分化数秒钟;用蒸馏水洗2次;用Ponceau's染色液滴染2min;直接用无水乙醇分化与脱水;二甲苯透明;中性树胶封固。观察方法:在光镜下观察[3]。

1.4.3 左室心肌间质超微结构 将大鼠迅速处死后,取左室心肌固定于pH7.4二甲砷酸钠配置的2%戊二醛溶液内,经取材心肌缓冲液冲洗后再固定于10%锇酸溶液中,按电镜常规技术脱水、包埋,用LKB Ⅴ型超薄切片机作超薄切片,经醋酸钠与枸橼酸铅双重染色,在日本电子1200EX透射电镜下观察并照像,并重点观察心肌细胞间胶原纤维的改变。

1.4.4 左室心肌Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及图像分析 石蜡切片,片厚5μm;二甲苯脱蜡;经各级酒精至水;0.2%胃蛋白酶溶液37℃1h;双蒸水洗涤5min×3次;0.6%过氧化氢―甲醇溶液37℃ 30min;双蒸水洗涤5min×3次;PBS洗涤5min×3次;加正常血清室温下20min;加第一抗体(1:100Ⅰ型胶原抗体)37℃1小时,4℃过夜;PBS洗涤5min×3次;滴加即用型envision置37℃烘箱40min;PBS洗涤5min×3次;加DAB溶液光镜观察下显色;水洗;0.5%甲基绿染色;用蒸馏水洗3次;37℃烘干,二甲苯透明;封片[4]。用石家庄华行医疗器械厂与河北医科大学联合生产的ZL2000细胞分析仪进行图象分析。

1.4.5 左室心肌Ⅲ型胶原免疫组织化学染色及图像分析 除第一抗体为1:100Ⅲ型胶原抗体外,余同Ⅰ型胶原。

1.5 统计分析

用SPSS 11.5统计软件进行统计处理,定量资料以均数±标准差(±s)表示。实验组和对照组之间比较采用两独立样本t检验,以P≤0.05表示差别有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

共有16只死亡,死后均有尸体解剖。假手术组1只因肠梗阻死于术后第4天;模型组中有3只死于术后2天之内,经证实均死于急性心功能衰竭;卡托普利组2只死于术后3天肠梗阻,2只死于术后2周后慢性心功能衰竭。补肾复方大剂量组、补肾复方小剂量组均有4只死于术后2天之内,经证实系死于急性心功能衰竭与术后肠梗阻。

2.2 左室重量指数(LVMI)

压力负荷增加大鼠各组左室重量指数的改变见表1,图1。模型组LVMI(‰)明显高于假手术组(P

表1 压力负荷增加大鼠

各组左室重量指数的改变(±s)

组别nLVMI(‰)

假手术组112.11±0.14

模型组92.98±0.36**

卡托普利组82.32±0.35##

补肾复方大剂量组82.35±0.39##

补肾复方小剂量组82.42±0.35##

注:与假手术组比较,**P

2.3 左室心肌病理形态胶原染色

假手术组在心肌细胞间仅有少许鲜红色胶原纤维。模型组在心肌细胞间有大量的鲜红色胶原纤维存在。卡托普利组、补肾复方大剂量组、小剂量组的改变与假手术组基本相似,见图1。

假手术组左室心肌病理形态胶原染色(×200)

模型组左室心肌病理形态胶原染色(×200)

卡托普利组左室心肌病理形态胶原染色(×200)

补肾复方大剂量组左室心肌病理形态胶原染色(×200)

补肾复方小剂量组左室心肌病理形态胶原染色(×200)

图1 左室心肌病理形态胶原染色

2.4 左室心肌间质超微结构

假手术组心肌细胞间仅有少许胶原纤维沉积。模型组心肌细胞间有较多的胶原纤维沉积。而卡托普利组、补肾复方大剂量组、小剂量组心肌细胞间胶原沉积明显减少,以补肾复方大剂量组减少最为显著,见图2。

2.5 左室心肌Ⅰ型胶原免疫组织化学染色及图像分析

压力负荷增加大鼠各组左室心肌Ⅰ型胶原的改变见表2。模型组Ⅰ型胶原的平均光密度与假手术组比显著升高(P

表2 压力负荷增加大鼠各组左室

心肌Ⅰ Ⅲ型胶原平均光密度的改变(±s)

组别nⅠ型胶原平均光密度Ⅲ型胶原平均光密度

假手术组80.1246±0.00500.1109±0.0024

模型组80.1575±0.0025**0.1378±0.0066**

卡托普利组80.1284±0.0051##0.1164±0.0033##

补肾复方大剂量组80.1300±0.0065##0.1153±0.0033##

补肾复方小剂量组80.1289±0.0052##0.1160±0.0052##

注:与假手术组比较,**P

2.6 左室心肌Ⅲ型胶原免疫组织化学染色及图像分析

压力负荷增加大鼠各组左室心肌Ⅲ型胶原的改变见表2。模型组Ⅲ型胶原的平均光密度与假手术组比显著升高(P

3 讨论

心肌纤维化(MF)是指在各种致病因素-炎症、缺血、缺氧等作用下,心肌的正常组织结构中胶原纤维过量积聚,心脏组织中胶原浓度显著升高或胶原成分发生改变。心肌纤维化是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键。心肌纤维化的消退可恢复心肌组织和间质之间平衡,使僵硬度正常化,有利于心功能的改善[5]。因此,预防和逆转心肌纤维化具有重要的意义。

ACEI是目前治疗MF的药物中研究最多、结果也较为肯定的一类药物。动物实验及体外培养的心脏成纤维细胞(CFs)研究表明,经ACEI治疗或处理后能减少胶原合成、预防和逆转MF[6]。除此之外,AT1受体阻断剂(ARB)、Ca2+通道阻滞剂(CCB)、醛固酮拮抗剂均有一定的抗纤维化作用,但具体作用尚不十分清楚。中医中药是我国医学的瑰宝,也有一些能保护器官及抗纤维化的药物。

如:丹参对人胚肺成纤维细胞(HLF)3HTdR和3H-Pro掺入有显著的抑制作用,并与浓度和时间有依赖性[7];还可以显著降低自发性高血压大鼠心肌Ⅰ和Ⅲ型胶原的含量,提示丹参具有预防和逆转心脏纤维化作用,其机制可能与其增加心脏局部NO浓度有关[8]。川芎及其提取物均能扩张冠状动脉,增加冠脉血流量,改善心肌的氧供和降低心肌的耗氧量,川芎嗪能明显抑制LPA诱导的细胞增殖[9];而中医复方抗纤维化也是一个很有研究价值和应用前景的领域,血府逐瘀汤是活血化瘀代表方,采用直接加药和血清药理学方法观察血府逐瘀汤不仅能抑制心肌成纤维细胞增殖,且抑制心肌成纤维细胞分泌胶原作用[10]。

笔者根据清•陈士铎《石室秘录》中指出“治心之所以治肾,而治肾之所以治心。”的这种“心肾相关”的治疗学理论,以及“久病归肾”、《石室秘录》“治心之所以治肾,而治肾正所以治心”的学术思想,确立平补肾阴肾阳的补肾复方治疗充血性心力衰竭。在临床应用有效的基础上,进一步采用腹主动脉银夹狭窄所致压力负荷增加的办法建立大鼠心肌纤维化模型,主要以心肌间质超微结构及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色等为指标,以卡托普利为对照组,观察以补肾法为主组成的补肾复方对压力负荷增加大鼠心肌纤维化的逆转作用。

结果模型组LVMI(‰)明显高于假手术组(P

参考文献

[1] Kass DA, Bronzwaer JG, Paulus WJ, et al. What Mechanisms Underlie Diastolic Dysfunction in Heart Failure [J].Circ Res, 2004, 94(12):1533-1542.

[2] Doering CW, Jalil JE, Janicki JS, et al. Collagen network remodeling and diastolic stiffness of the rat left ventricle with pressure overload hypertrophy[J]. Cardiovasc Res, 1988, 22: 686-695.

[3] Botchway AN, Turner MA, Sheridan DJ, et al. Electrophysiological effects accompanying regression of left ventricular hypertrophy [J]. Cardiovasc Res, 2003, 60(3): 510-517.

[4] 王新禾,张月娥,张锦生,等.人Ⅰ、Ⅲ型胶原的提取及其抗血清的制备[J].上海医科大学学报,1994, 21(6):405

[5] Cuspidi C, Ciulla M, Zanchetti A, et al. Hypertensive myocardial fibrosis[J]. Nephrol Dial Transplant, 2006, 21: 20-23.

[6] DerSarkissian S, Marchand EL, Duguay D, et al. Reversal of interstitial fibroblast hyperplasia Via apoptosis in hypertensive rat heartwith valsartan or enalapril[J]. Cardiovasc Res, 2003, 57(3): 775-83.

[7] 郭传勇,李定国,田字彬,等.丹参及川芎嗪对人成纤维细胞DNA和胶原合成的影响[J].上海第二医科大学学报,1996, 16(3): 217-219.

[8] 陈静,许喜泳,刘淑华.银杏叶片对冠心病心绞痛患者血浆内皮素和一氧化氮含量的影响[J].数理医药学杂志,2002, 15(6): 517-518.

[9] 蔡辉,修春英,郭郡浩,等.川芎嗪对溶血磷脂酸诱导的心脏成纤维细胞增殖及胶原合成的影响[J].医学研究生学报, 2008, 21(1): 31-33.

[10]丁志山,高承贤,吉瑞瑞,等.血府逐瘀汤对心肌成纤维细胞增殖和胶原合成影响[J].中药材, 2002, 25(7): 481-483.