活血利水法对外伤性增生性玻璃体视网膜病变模型兔眼IGF-1表达的影响
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇活血利水法对外伤性增生性玻璃体视网膜病变模型兔眼IGF-1表达的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
(1.湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科,湖南 长沙 410007;2.上海市嘉定区中医医院眼科,上海 201800;
3.浏阳市集里医院眼科,湖南 浏阳 410300;4.南京市雨花台区妇幼保健所眼科,江苏 南京 210012)
摘 要:目的:观察活血利水之散血明目片对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(traumatic Proliferrative Vitreoretinopathy, tPVR)增殖膜(ERM)中胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)表达的影响。方法:将40只家兔随机抽取32只,造成外伤性PVR模型,随机分成活血利水组、活血化瘀组、利水明目组、模型组,另8只为空白组。连续灌胃28天后,观察眼底PVR分级情况,免疫组织化学方法检测胰岛素样生长因子-1(igf-1)在各组的表现及病理组织学改变。结果:在活血利水组,ERM中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)阳性程度低于模型组,差异有非常显著性(P
Effects of Method of Activating Blood and Diuresis on Expression of IGF-1 of
Rabbits’ Traumatic Proliferative Vitreoretinopathy Model
XING Yanfei1,2,PENG Qinghua1, FU Meilin1,3,CHEN Ji1,4
(1.Key Disciplinary of Ophthalmology Department of the First Affiliated Hospital of
Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410007,Hunan,China;
2.Department of Ophthalmology, TCM Hospital of Jiading District,Shanghai 201800,China;
3.Department of Ophthalmology, Jili Hospital of Liuyang, Liuyang 410300,Hunan,China;
4.Department of Ophthalmology,Maternal and Children Health Hosptial of Yuhua District,Nanjing 210012,Jiangsu,China)
Abstract:Objective: To investigate the effects of SanXue MingMu Tablets(SXMMT) of activating blood and diuresis on expression of insulinlike growth factor-1(IGF-1) in epiretinal membrane(ERM) of traumatic proliferative vitreoretinopathy.Methods:32 rabbits were selected randomly from 40 rabbits and made to traumatic proliferative vitreoretinopathy models, then divided into four groups: the first group was treated with activating blood and diuresis group, the second treated with activating blood and removing stasis group, the third treated with activating diuresis and brightening eye group and the model group. The rest 8 were formed the blank control group. After the rabbits had been administrated intragastrically for 28 days, we observed the classification of PVR and expressions and pathologic changes of IGF-1 measured by immunohistochemistry in each group. Results: Compared with model group ,the positive level of IGF-1 was decreased significantly in activating blood and diuresis group (P
Key words:method of activating blood and dieresis; SXMM tablet; traumatic proliferative vitreoretinopathy; insulinlike growth factor-1
外伤性增生性玻璃体视网膜病变(traumtic proliferative vitreoretino- pathy,tPVR)是指发生孔源性视网膜脱离及穿通性眼外伤后,因创伤修复的过度瘢痕化所引起的牵引性视网膜脱离。在炎症刺激下的纤维组织增生和玻璃体或视网膜在伤口的嵌顿,是其主要的发病机制。tPVR在祖国医学中可归属于“暴盲”、“云雾移睛”或“视瞻昏渺”等范畴,属于“外不见证,从内而蔽”的内障眼病。笔者导师结合长期临床实践,研制出具有活血利水之功效的散血明目片,不仅在临床取得了良好的疗效,且通过严谨的科学实验证实其对兔视网膜具有保护作用。本课题将进一步研究活血利水法对实验性t-PVR模型兔眼胰岛素样生长因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)浓度的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物
有色家兔40只,雌雄各半,体质量2.0～2.5kg,经检查无眼疾,由湖南中医药大学动物实验中心提供。
1.2 药物及试剂
散血明目片:由三七、酒大黄、蒲黄、防己、猪苓等活血通脉利水明目中药按现代制剂制备工艺制成,0.3g/片,选用同一批号药物,批号:020624。由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。使用时研成粉末,温开水混合,浓度为100mL含散血明目片12g的混悬液。
止血祛瘀明目片:由丹参、三七、赤芍、地黄、墨旱莲、茺蔚子、牡丹皮、女贞子、夏枯草、毛冬青、大黄、黄芩(酒炙)等制成,薄膜衣片每片重0.3g,选用同一批号药物,批号:国药准字Z20025316。由陕西摩美得制药有限公司生产。使用时研成粉末,温开水混合,浓度为每100mL含止血祛瘀明目片12g的混悬液。
猪苓散加减:猪苓10g,泽泻10g,茯苓15g,狗脊10g,大黄10g,栀子10g,滑石10g,车前子15g。原方出自《审视瑶函》。使用时煎成汤剂,浓度为100mL含生药130g。
兔抗IGF-1试剂盒:由武汉博士德生物工程有限公司提供,编号:PR2318。
1.3 造模方法
参照万光明等[1]提出的方法,并加以改进。
1.3.1 富含血小板的血浆(platelet-rich plasma,PRP)的制备 用含3.8%枸橼酸钠的玻璃离心管收集健康有色家兔耳缘静脉血(静脉血与枸橼酸钠体积比为9∶1),轻轻摇动混匀,室温下以3000r/min离心5min,取上1/3之上清液,进行血小板计数,获得血小板浓度为5×105～10×105/mL的血浆,即PRP[1]。
1.3.2 有色家兔32只,1%阿托品眼水充分散瞳后,耳缘静脉注射25%乌拉坦4mL/kg。每只兔右眼为实验眼,颞上方注入透明质酸酶0.1mL并反复抽吸,再分离3～9点的球结膜和筋膜,在角膜缘后6mm处用巩膜穿刺刀刺向玻璃体中心部,勿伤及晶状体及周边视网膜,用剪刀向两侧扩大切口,伤口与角膜缘平行达8mm。轻压眼球,将脱离的玻璃体剪除,用8-0尼龙线间断缝合切口。玻璃体腔中央注入0.1mL的PRP(约含70000个血小板)。术毕予地塞米松10mg+庆大霉素2万U各0.1mL球结膜下注射。造模后一周内用0.3%诺氟沙星滴眼药滴右眼,3次/天,0.5%托吡咔胺滴右眼,3次/天。
1.4 动物分组
健康有色家兔40只,随机抽取8只(8只眼)为空白组(A组),其余32只(32只眼)造成右眼tPVR模型,并随机分为模型组(B组)、利水明目组(C组、用猪苓散)、活血化瘀组(D组、用止血祛瘀明目片)、活血利水组(E组、用散血明目片),每组均为8只(8只眼)。
1.5 给药方法及标本采集
造模后第2天开始给药,A组与B组均予温开水灌胃,5mL/kg,2次/天。C组(利水明目组)予猪苓散灌胃6.5g/(5mL•kg)(每mL含生药1.3g),2次/天,均相当于成人剂量。D组用(止血祛瘀明目片组)1.2g/(5mL•kg),用时研成粉末,温开水混合灌胃,2次/天,均相当于成人剂量。E组予散血明目片混悬液,按0.6g/(5mL•kg)灌胃, 2次/天。各组均灌胃28天后用空气栓塞法处死动物,即行眼球摘除术,并在上极象限作球冠形开窗,观察增殖膜分级情况后,剔除角膜和眼内容物,以造模时的巩膜切口为分界将眼球壁分为两半,取一半眼球壁,立即置于4%的多聚甲醛溶液中,保存于4℃下固定,以备组织观察。另一半眼球壁标本小心剥离视网膜及增殖膜组织,置于液氮灌冰冻保存,待测IGF-1。
1.6 观察指标与方法
1.6.1 PVR 分级 用直接检眼镜检查,观察PVR 分级,采用 Weiss 的评级方法[2],将病变分为六级:0 级:无增生;05 级:玻璃体勉强可见增生痕迹;1 级:细小的增生束,但无真正的条索形成;2 级:有浓厚的增生束,但无真正的增生条索形成;3 级:有细薄的增生条索;4 级:有浓厚的增生条索。
1.6.2 增殖膜IGF-1的测定 将固定后的眼球壁标本沿矢状面分一半脱水后石蜡包埋,切片,切片厚4μm,经苏木素伊红染色(HE) ,封片后镜检,显微摄影;将另一半眼球壁标本同样脱水、石蜡包埋、切片,然后以免疫组化法进行IGF-1的检测:石蜡切片4μm,常规脱蜡和水化,3%H2O2室温处理10min;微波炉热修复抗原;正常山羊血清封闭30min,吸取多余液体,不洗,滴加1∶100稀释的兔抗IGF-1抗体;滴加生物素化羊抗兔IgG;滴加SABC;每一步之间用0.1mol/LPBS充分洗涤。最后,显微镜下控制DAB显色时间,苏木素复染,脱水,透明,封片。具体步骤按照试剂盒说明进行,阴性对照用PBS代替一抗。DAB显色,光镜下胞浆呈棕黄色颗粒者为阳性。用显微图象分析仪对切片进行图像分析,所有切片均在同一放大倍数(10×40)及同一光强度下分析,测量阳性染色区域,每例动物测10张切片,取平均值。观察指标:①平均光密度;②阳性产物平均灰度值(系统设定白色最大灰度为256,黑色最小灰度为0)。实验数据以平均值±标准差(±s)表示。
1.7 统计学处理
所有数据均采用SPSS 14.0版统计软件包处理,方差齐用f检验,方差不齐用t检验;两两比较用q检验;频数资料用秩和检验。
2 结 果
2.1 眼底观察及PVR分级情况
空白组兔眼玻璃体透明,视网膜结构清晰,温开水灌胃28天眼底无变化。
给药后第1天,少部分兔眼眼底用直接检眼镜看不见视网膜红光反射,大部分玻璃体腔中可见界限清楚成团的雾状混浊,眼底视网膜结构隐约可见。
给药后第7天,各组兔眼玻璃体中可见灰白色尘埃状团块,极少数可见灰白色细小条索状物。
给药后第14天,各组玻璃体中可见灰白色膜样混浊。模型组中玻璃体腔中出现粗细不匀的纤维增生条索;活血化瘀组与利水明目组亦有部分出现纤维增生条索,较模型组少;活血利水组均可见增生束,少数可见增生条索。
给药后第21天,模型组中的纤维条索渐增大,少数眼可见较粗大的条索,并牵拉视网膜,开始出现局部视网膜脱离及视网膜皱褶;活血化瘀组及利水明目组玻璃体的条索较模型组少,少数可见粗大条索;活血利水组玻璃体中可见少量细小增生条索,未见粗大的增生条索。
给药后第28天,各组的玻璃体混浊均较前减轻,眼底红色反光增强。模型组多数眼可见较粗大而杂乱的增生条索,部分出现视网膜脱离及皱褶;活血化瘀组及利水明目组可见少量粗大增生条索及局限性牵拉性视网膜脱离;活血利水组仅见程度不等的细条索,未见粗大的增生条索及牵拉性视网膜脱离。
各组中不同时期的PVR分级情况见表1～5。
经统计分析(秩和检验,P0.05);给药14天后各组之间
表1 第1天各组PVR分级比较
组别/Weiss分级00.51234
B组(模型组)530000
C组(活血化瘀组)440000
D组(利水明目组)530000
E组(活血利水组)530000
表2 第7天各组PVR分级比较
组别/Weiss分级00.51234
B组(模型组)322100
C组(活血化瘀组)322100
D组(利水明目组)223100
E组(活血利水组)341000
表3 第14天各组PVR分级比较
组别/Weiss分级00.51234
B组(模型组)002321
C组(活血化瘀组)122120
D组(利水明目组)331100
E组(活血利水组)002312
表4 第21天各组PVR分级比较
组别/Weiss分级00.51234
B组(模型组)000242
C组(活血化瘀组)012320
D组(利水明目组)231110
E组(活血利水组)002222
表5 第28天各组PVR分级比较
组别/Weiss分级00.51234
B组(模型组)000233
C组(活血化瘀组)012221
D组(利水明目组)231110
E组(活血利水组)002132
有显著性差异(P
2.2 增殖膜IGF-1的测定
免疫组化染色观察结果:给药28天后IGF-1的表达在空白组视网膜仅见极少量的染色,在各造模组增生膜内的部分增殖细胞的细胞膜内,胞浆内均可见棕褐色阳性表达,增生的纤维组织有轻度着色。其中模型组呈现IGF-1高表达,各组增生膜上IGF-1阳性表达统计结果见表6。各组IGF-1免疫组化染色见图1～5。
表6 各组ERM中IGF-1的表达阳性指标测定
分 组nAOD平均光密度测量值(±s)
A 空白组80.195±0.015
B 模型组80.586±0.033
C 活血化瘀组80.402±0.044■
D 利水明目组80.414±0.034■
E 活血利水组80.237±0.054■
注:与空白组比较,有显著性差异: P
由表6可知,各用药组玻璃体腔增生膜IGF-1阳性细胞数明显少于B组,有显著性差异(P
视网膜上可见少量棕褐素颗粒,提示
IGF-1在正常视网膜组织上也有极少量的表达。
图1A空白组
组织胞浆可见大量棕褐色颗粒,提示IGF-1在增殖膜上表达显著增强,程强阳性。
图2B模型组
增殖膜上IGF-1阳性表达与B组比较,C组程度明显降低。
图3C活血化瘀组
组织胞浆可见较多棕褐色颗粒,
提示IGF-1在增殖膜上阳性表达比B组明显降低。
图4D利水明目组
组织胞浆可见少量棕褐色颗粒,说明IGF-1在该组阳性表达程度较B、C、D组显著降低,呈弱阳性。
图5 E活血利水组
3 讨 论
3.1 中医学有关PVR的认识
在中医学文献中并无tPVR的专门记载,但根据其临床表现,可归属于“暴盲”、“云雾移睛”或“视瞻昏渺”等范畴,属于“外不见证,从内而蔽”的内障眼病。中医学认为,视衣(视网膜) 为瞳神深部组织, PVR 属内障眼病,故归属于瞳神疾病范畴;而玻璃体为神膏、护睛水,认为是胆中精汁渗润精华而成,并靠气血濡养而发挥作用,亦属瞳神范畴。中医对视网膜增殖物的辨证,认为由出血所致日久不散变生膜状物,多属气血瘀滞;由炎症所致的增殖,多因痰湿凝结所致。
笔者认为外伤性PVR的发生机理为眼部外伤后损及脉络致血不循经,溢于脉外,出血日久不散变生膜状物而发本病。正如唐容川在《血证论》所述:“血积既久,其水乃成”;“水病而累及血,瘀血化水”。血不利则为水,水湿上泛,痰湿凝结导致视网膜增殖物形成。符合中医“水血互结”之病机。《审视瑶函》谓“物秽当洗,脂膏之釜,不经涤洗,蔫能洁净”。根据水血互结之病机,笔者在治疗上主张用活血通脉利水明目法以活其血、利其水、散其结,组方散血明目片,在临床已经取得了良好的疗效[3]。
3.2 活血利水之散血明目片对兔眼增殖膜IGF-1表达的影响
PVR的启动和发展表现为过度的创伤愈合过程,大致分为3个阶段,即炎症反应期、增殖期及瘢痕重塑期。其基本的病理过程是视网膜色素上皮细胞(RPEc)的移行增生,在视网膜前、后及玻璃体腔内形成膜,属于细胞增生性疾病。目前认为,生长因子 (Growth- factors)在细胞增生的调控中起着重要作用,它们可能参与某些眼后节疾病的发生发展过程。相关研究表明, 胰岛素样生长因子( insulin-like growth factor,IGF)与血小板源性生长因子(PDGF)是血浆最有效的促生长的活性因子,而IGF-1是一种结构和功能都与胰岛素类似的多肽类神经营养因子,具有广泛的生物学活性,调节神经细胞的生长、增殖、分化、迁移和抑制细胞凋亡。Lambooi等[4]研究证明,在正常视网膜,IGF-1和IGF-1受体mRNA分布在视网膜神经感觉层、视网膜色素上皮细胞、脉络膜视网膜毛细血管内皮细胞,说明正常视网膜有自分泌IGF-1的功能。同时,大量的相关研究证明IGF-1 可引起视网膜血管增殖,导致新生血管形成。Tomas[5]也指出, IGF-1 在新生血管形成的过程中不仅能促使细胞迁移和增殖,而且还能增加视网膜胶原的形成,后者能溶解视网膜胶原、基质及血管的基底膜,使内皮细胞易于移动,导致新生血管和增生性视网膜病变的发生。Jaffa[6]研究表明全身IGF-1 水平的降低可以阻止视网膜新生血管形成。而全身IGF-1 增高,可诱导血- 视网膜屏障渗透性增高,进一步导致眼球内IGF-1 水平的增高[7]。以上研究均提示IGF-1 在增殖性病变的发生发展可能起重要作用。因此,应用有效药物通过干预IGF-1来治疗增殖性视网膜病变,并改善患者全身代谢水平,成为治疗增殖性视网膜病变的一个新途径。
本实验结果显示,活血利水法治疗(用散血明目片)在抑制PVR发展过程中起作用,且效果优于单纯活血化瘀法与利水明目法。散血明目片由三七、酒大黄、蒲黄、猪苓等药物组成,共奏活血通脉、利水明目之功。笔者的前期研究已证实[8], 散血明目片确有促进溶血,促进巨噬细胞的趋化和吞噬,促进血液循环,加速积血清除的作用。因此在本实验加速了玻璃体积血的消除,减少积血对视网膜的毒性损伤,减少巨噬细胞的浸润及炎性因子的释放,并通过活血利水作用改善全身的代谢水平,从而降低了外伤性PVR中IGF-1的高表达,也因此减少视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、神经胶质细胞等迁移与增殖,进而抑制PVR的形成和发展。
参考文献
[1] 万光明.一种新的PVR模型的制作与评价[J].中国实用眼科杂志,2003,21(2):148-149.
[2] Weiss J F ,Belkin M. The effect of penicillamine on post vitreous proliferation[J]. Am J Ophthalmol,1987,92:625.
[3] 彭清华,喻京生,曾明葵,等.活血通脉、利水明目法治疗玻璃体积血的临床研究[J].湖南中医学院学报,2003,23(1):39-42.
[4] LambooijAC, van Wely KH,Lindenbergh-Kortleve DJ,Kuijpers RW, Kliffen M, Mooy CM.Insulin-like growthfactor-I and its receptor in neovascular age-re lated macular degeneration[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44(5):2192-2198.
[5] Thomas M. An interact between diabetic retinopathy, diabetes management and insulin-like growth factors[J]. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism ,1997,9:2086-2091.
[6] Jaffa AA. Induction of renal kallikrein and ienin gene expression by insulin and IGF-1 in the diabetic rat[J]. J Diabetes,1997,46:2049-2056.
[7] Jaffa AA,Vio C,Velarde V, et al. IGF-1 decreases collagen degradation in diabetic NOD mesangial cells:implication for diabetic nephopathy[J]. J Diabetes,1999,48 :1638-1644.
[8] 张琳,彭清华,李建超.散血明目片治疗家兔玻璃体积血的实验研究[J].中国中医眼科杂志,2002,12(2):63-65.