葛根多糖提取条件的优化及其抗氧化活性的研究

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摘要：采用乙醇回流法从葛根（Radix Puerariae）渣中提取葛根多糖，在单因素试验的基础上设计正交试验优化多糖提取工艺，并测定提取的葛根多糖的抗氧化活性。结果表明，优化的乙醇回流法提取葛根多糖的工艺条件为回流时间2.0 h、乙醇体积分数75%、料液比1∶40（m∶V，g/mL）、回流温度95 ℃，葛根多糖提取率为1.209%。提取的葛根多糖对O2—·和H2O2均有一定的清除作用，浓度为200 mg/L时，其对O2—·和H2O2的清除率分别为18.52%和13.68%。

关键词：葛根（Radix Puerariae）渣；多糖；乙醇回流法；抗氧化活性

中图分类号：O629.12 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4344—04

葛根（Radix Puerariae）是多年生藤本植物野葛（Pueraria lobata）的根，始载于《神农本草经》，具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻等功效[1]。中国葛根资源极为丰富，除新疆、、青海外，各省均有分布[2]。目前对葛根的研究和利用尚处于起步阶段，主要是从葛根中提取淀粉和黄酮类化合物，提取之后剩下大量的葛根渣。葛根渣含有大量粗纤维及多糖等营养成分，但是喂猪不消化，作肥不腐烂，随意倾倒又造成环境污染和资源浪费，加强葛根渣的综合利用是葛根加工业中一个亟需解决的重要问题。

大量药理及临床研究证实，多糖具有多种生物学功能，如降血糖作用[3]、提高机体的免疫功能[4]、抗辐射[5]、抗病毒[6]、抗肿瘤[7]、抗衰老[8]、抗氧化活性[9]、保鲜[10]、抗突变[11]等。本研究以乙醇溶液为提取溶剂，通过加热回流方式从葛根渣中提取多糖，优化提取工艺并测定其抗氧化活性，旨在为葛根多糖的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

试验仪器：UV—2102.PC型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司），SSW型微电脑电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），电子天平（梅特勒—托利多仪器上海有限公司），微量移液器（上海荣泰生化工程有限公司），SHZ—III型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）。

试验试剂浓硫酸、苯酚、葡萄糖、邻苯三酚、Tris等均为国产分析纯。

试验材料野生葛根渣取自上饶县农户，为葛根提取葛粉之后晒干的残渣。

1.2 试验方法

1.2.1 苯酚—硫酸法制作葡萄糖标准曲线[12] 分别取0.506 mg/mL葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于试管中，加水补至2.0 mL，另一试管加入2.0 mL蒸馏水作为空白对照。各试管分别加入60 mg/mL的苯酚1.0 mL，然后迅速加入98%的浓硫酸5.0 mL，摇匀，放置5 min，置沸水浴中水浴15 min。取出冷却至室温后于490 nm处测定其吸光度。以葡萄糖溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。葡萄糖在0～0.253 0 mg/mL范围内浓度（X//mg/mL）与吸光度（A490 nm）呈良好的线性关系，回归方程为Y=5.814 2X+0.114 3，r=0.990 8。

1.2.2 单因素试验 准确称取干燥的葛根渣5 g，加入一定体积的乙醇溶液，在一定温度下加热回流一定时间后过滤，收集滤液，定容至100 mL，制得样液，参照“1.2.1”的方法测其吸光度，根据回归方程计算样品溶液中多糖的浓度，并计算葛根多糖提取率。设置单因素试验考察回流时间、加热温度、乙醇溶液体积分数和料液比对多糖提取率的影响。①回流时间。在回流温度80 ℃、料液比1∶20（m∶V，g/mL，下同）、乙醇体积分数80%的条件下分别回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。②乙醇体积分数。分别采用体积分数75%、80%、85%、90%的乙醇作为提取剂，在回流温度80 ℃、料液比1∶20的条件下回流1 h。③料液比。回流温度80 ℃、分别按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比加入体积分数80%的乙醇，回流1 h。④回流温度。按1∶40的料液比加入体积分数80%的乙醇，分别在80、85、90、95 ℃回流1 h。

1.2.3 正交试验 在单因素试验的基础上设计四因素三水平正交试验，进一步优化提取工艺，因素与水平见表1。

1.2.4 葛根多糖还原能力的测定[13]

1）对超氧阴离子自由基（O2—·）的清除作用。将按最佳工艺条件提取得到的多糖溶液配制成20、40、80、200 mg/L的溶液。取50 mmol/L pH 8.2的Tris—HCl缓冲溶液（含1 mmol/L EDTA）7.0 mL，加入1.0 mL去离子水，混匀后25 ℃水浴20 min，取出后立即加入1.0 mL 25 ℃预热的3 mmol/L邻苯三酚，混匀后立即倒入比色池，以蒸馏水为空白对照，于325 nm处每隔30 s测定一次吸光度，共测定5 min，其吸光度随时间的变化率记作A；在加入邻苯三酚前先加入1.0 mL不同浓度的多糖溶液，其吸光度随时间的变化记作B。

多糖对O2—·的清除率E1=（1—A/B）×100% （1）

2）对过氧化氢（H2O2）的清除作用。4份1 mL浓度分别为20、40、80、200 mg/L的多糖样品溶液与6.0 mL磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 7.4）、1.0 mL 50 mmol/L H2O2溶液混合，摇匀，10 min后以蒸馏水为空白对照于230 nm波长处测定吸光度。

多糖对H2O2的清除率

E2=[1—（A1—A2）/A3]×100% （2）

式中，A1为试验体系的吸光度；A2为只含多糖溶液的吸光度；A3为只含H2O2溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 回流时间对葛根多糖提取率的影响 回流时间对葛根多糖提取率的影响结果见图2。由图2可知，回流时间从0.5 h延长到1.0 h，葛根多糖提取率迅速上升，之后再延长回流时间，提取率反而下降。可能是由于回流时间过长导致杂质过多，且已溶出的多糖易在加热条件下分解，因此以下单因素试验回流时间均为1.0 h。

2.1.2 乙醇体积分数对葛根多糖提取率的影响 葛根多糖提取率随乙醇体积分数变化而变化的结果见图3。由图3可知，多糖提取率随乙醇体积分数的升高呈先上升后下降的趋势。乙醇体积分数为80%时多糖提取率最大，乙醇体积分数进一步增大，多糖提取率下降。这可能是因为高浓度乙醇会造成葛根渣纤维收缩，使多糖溶出困难。因此以下单因素试验均以体积分数80%的乙醇为提取剂。

2.1.3 料液比对葛根多糖提取率的影响 料液比对葛根多糖提取率的影响结果见图4。由图4可知，多糖提取率随着料液比的减小先增加，在料液比为1∶40时最大，此时大部分多糖已溶出，再增加提取剂的用量，多糖提取率增加不明显，甚至有所降低，且不利于后续多糖的浓缩和提纯。

2.1.4 回流温度对葛根多糖提取率的影响 回流温度对葛根多糖提取率的影响结果见图5。由图5可知，回流温度低于90 ℃时，提取率随着温度的升高而缓慢升高，温度高于90 ℃时提取率有所下降。可见较高的提取温度有利于多糖的溶出，但过高的温度会导致多糖的降解，反而不利于提高提取率。

2.2 正交试验结果

从正交试验结果（表2）可知，4个因素对葛根多糖提取率的影响由大到小依次为乙醇体积分数、料液比、回流温度、回流时间。最佳试验组合为A3B1C3D3，即回流时间2.0 h、乙醇体积分数75%、料液比1∶40、回流温度95 ℃。按此条件进行验证试验，葛根多糖提取率为1.209%，高于所有正交试验组合的提取率结果，可见优化的试验方案是可靠的。

2.3 葛根多糖的抗氧化作用测定结果

2.3.1 葛根多糖对超氧阴离子自由基（O2—·）的清除作用 不同浓度葛根多糖对O2—·的清除率见图6。由图6可以看出，葛根多糖对邻苯三酚自氧化反应产生的O2—·具有一定的清除作用，且随多糖浓度的增加清除效果增强。多糖浓度为200 mg/L时，其对O2—·的清除率为18.52%。

2.3.2 葛根多糖对过氧化氢（H2O2）的清除作用 不同浓度葛根多糖对H2O2的清除作用结果见图7。由图7可以看出，葛根多糖对H2O2具有一定的清除作用，且随多糖浓度的增加清除效果增强。多糖浓度为200 mg/L时其对H2O2的清除率为13.68%。

3 结论

根据单因素试验和正交设计确定乙醇回流法从葛根渣中提取葛根多糖的最佳工艺条件为回流时间2.0 h、乙醇体积分数75%、料液比1∶40、回流温度95 ℃。所得提取液对碘—碘化钾反应呈阴性，说明其中不含淀粉。按此条件提取的葛根多糖对O2—·和H2O2均具有一定的清除能力，且在试验范围内清除效果随着多糖浓度的升高而增强。多糖浓度为200 mg/L时，其对O2—·和H2O2的清除率分别为18.52%和13.68%。

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