基因序列测定中不确定性结果分析及测序技术发展

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇基因序列测定中不确定性结果分析及测序技术发展范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

【摘要】 目的 对HLA/MICA基因序列测定结果的不确定结果进行分析，制定相应解决方案，探讨基因测序技术发展新方向。 方法 对300人份样本分别采用商品化及自行设计HLA、MICA基因第2至4外显子扩增引物及测序引物，对基因序列测定结果的不确定结果进行统计学分析，并采用PCR-SSP及自行建立的组特异性引物测序分型法确证实验结果。结果 发现3例样本的基因分型结果不确定，应用本研究建立的双向及组特异序列引物测序分型方法确正了不确定的基因测序分型结果。HLA/MICA等位基因引物设计区存在单核苷酸多态性。结论 建立或采多种基因双向测序方法，是保证组织器官移植配型及与基因相关疾病诊断检测不可缺少的辅助检测手段。

【关键词】 人类白细胞抗原;人类主要组织相容复合I类相关基因A；基因测序；多态性

【中国分类号】 R52 【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0103-02

【Abstract】 To analysis the uncertainty results for HLA/MICA genotyping in sequence-based typing (SBT), formulate the corresponding solution and discusses the new gene sequencing technology development direction. Methods A total of 300 samples were genotyped respectively by commercialization kit and designed, the results of uncertainty were used by the amplification of HLA/ MICA gene 2 to 4 exon in house group-specific sequencing primers. Results The 3 cases of sample genotype can not be determined, then we have confirmed these genotype results by in house method. There are some polymorphism single-nucleotidepolymorphisms(SNPs) in primer area in MICA allele typing. Conclusion It is necessary process that some new genotyping strategies would be established or adopted for the organization organ transplant matching and gene related diseases diagnostic.

【Keywords】 Human leukocyte antigen; Human major histocompatibility complex class I chain-related gene A （MICA）; Sequencing; polymorphism

目前国际和国内用于基因与疾病检测的DNA序列测定技术大部分是采用1977年Sanger在加减法基础上创造了双脱氧核苷酸末端终止法，它是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，通过ABI DNA测序仪进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列，可对长达1,000bp的DN段进行测序。这一技术的前提是对目的片断进行精确扩增，如果待测序模板片段与目的片断不匹配，则所得序列结果可能不是真实的结果，得不出精确的结果［1-2］。本研究以人类主要组织相容抗原（human leukocyte antigen，HLA）HLA复合I类相关基因A（Human major histocompatibility complex class I chain-related gene A ，MICA）HLA与人类主要组织相容复合I类相关基因A（Human major histocompatibility complex class I chain-related gene A ，MICA）基因测序为例，探讨DNA双脱氧核苷酸末端终止法DNA基因测序中应当注意的一些问题及解决策略。

1 材料与方法

1.1 标本来源:300份标本来源于深圳市血液中心自愿无偿献血者，标本之间无血缘关系，其中男195例，平均年龄27.5岁，女105例，平均年龄29.3岁。

1.2 基因组DNA提取:使用Gentra DNA提取试剂（美国，Gentra公司)制备基因组DNA，DNA浓度调至35～70 ng/?L，纯度(A260/280)为1.70～1.80。

1.3 HLA基因测序分型:采用聚合酶链反应测序分型法（PCR-sequence-based typing，SBT）Atria公司试剂盒（Atria Genetics AlleleSEQR HLA-A，B，测序试剂盒, South San Francisco,CA)分别扩增HLA-A 、B,等位基因第2,3和4 外显子，测序反应、产物纯化均按试剂盒说明书操作，测序产物使用ABI3730型序列分析仪进行毛细管电泳。测序图谱使用Assign version 3.5 版（Conexio Genomics,Applecross,Western Australia ）软件分析。部分样本的分型结果，应用序列特异性引物(Sequence Specific Primer, SSP)分型方法，Olerup公司试剂盒鉴别。

1.4 MICA基因分型 根据GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene- bank)中公布的人类基因组MICA基因组序列NM_000247作为参考序列，采用在线Primer3软件，自行设计1对PCR扩增引物，上游引物位置在MICA基因第1内含子区域，下游引物位置在MICA基因第5内含子区域，详见表1，特异性的扩增MICA基因第2-5外显子及第2、3、4内含子序列，目的片断2249bp。PCR反应体系、扩增条件、产物纯化、结果分析详见正发表文章。

2 结果

2.1 HLA基因分型结果:297例样本均得到准确的基因分型结果，3例样本的基因分型结果不能确定，第1例见图1，经聚合酶链式反应序列特异性引物分析法(sequence specific primer, PCR-SSP)及组特异性引物测序结果确证，为反向PCR的扩增引物不匹配。

图1正反向测序峰图不匹配图

第2例为等位基因丢失，见图2，表现在204bp位杂合峰丢失，经组特异性引物扩增确证，该碱基位PCR扩增不匹配。

图2 杂合峰丢失测序图。

第3例为等位基因型不确定，表现在两个碱基的峰高值差异太大，见图3。

2.2 HLA/MICA基因分型结果确证实验结果 3例不确定的基因分型结果，采用PCR-SSP及组特异性引物扩增测序法，并根据目的片断上下序列多态性特征，确证了基因分型结果。

2.3上游引物区多态性情况分析 MICA第1含子引物设计区存在SNPs多态性。

MICA第1内含子区部分序列多态性图

3 讨论

人类白细胞抗原(Human leukocyte antigens，HLA)复合于第六号染色体短臂6p21.3，是造血干细胞及器官移植重要免疫抗原［3］。MICA基因位于HLA-B位点附近，近着丝粒端约46kb处，为非经典HLA-I类基因家族的功能基因，MICA基因的多态性与多种自身免疫性疾病及器官移植有一定的相关性［4］。这些基因无论在外显子区还是在内含子区都具有遗传多态性，以MICA基因为例，见图3。

本研究结果图1，2，3可见，在基因测序结果中一些样本仍可能由于扩增引物的不匹配造成基因分型结果的不确定性，其原因可能有以下几方面，一是由于设计的扩增引物不匹配，二、由于在一个反应体系中扩增的目的片断GC含量较高，可能存扩增的竞争抑制现象，三是可能目的模板DNA纯化未正理好，扩增不完善等原因造成，本研究结果可见通过改善PCR扩增测序引物，采用PCR-SSP方法及优化PCR扩增测序条件得到了精确的测序结果。

国际上采用DNA双脱氧核苷酸末端终止法进行基因分型而产生基因丢失及得不到确定基因型情况并不少见［5］，例如Hussain Askree S等报道了他们实验室在为一个多基因疾病实验检测时发现家系检测结果不符合调查结果，进一实验及网上DNA数据比对结果表明目的片断核苷酸变化导致等位基因"扩增丢失"现象，说明了由于等位基因"扩增丢失"现象的存在，稀有多态性能引起假阳性结果。

近年来国际公布了新一代的半导体芯片基因测序仪，其中一些技术得到改进，其原理是对DNA复制时产生的离子流实现直接和实时的检测，从理论上来说由于其化学测序原理自然简单，采用无修饰的核苷酸，可能降低了本研究中不确定结果的产生，该项技术有待于实际运用时进行数据统计和分析。

综上所述，采用DNA双脱氧核苷酸末端终止法进行基因测序分型时应当注意测序结果分析，在不确定基因型情况下需进一步采用本研究所建立的方法做进一步确证性实验，以保证基因分型结果的准确性。

参考文献

［1］ Solgi G, Furst D, Mytilineos J,et al.Clinical relevance of pre and post-transplant immune markers in kidney allograft recipients: Anti-HLA and MICA antibodies and serum levels of sCD30 and sMICA.Transpl Immunol. 2012 Mar;26(2-3):81-7.

［2］ Paantjens AW, van de Graaf EA, Kwakkel-van Erp JM,et al.The Induction of IgM and IgG Antibodies against HLA or MICA after Lung Transplantation.Pulm Med. 2011;2011:432169. Epub 2011 Aug 29.

［3］ Yanover C, Petersdorf E, Bradley P.HLA mismatches and hematopoietic cell transplantation: structural simulations assess the impact of changes in peptide binding specificity on transplant outcome.Immunome Res. 2011 Nov 20;7(2):24.

［4］ Simrit Parmar1,Marcos del Lima1, Yizhou Zou, et al. Donor-recipient mismatches in MHC class I chain-related gene A in unrelated donor transplantationlead to increased incidence of acute graft-versus-host disease. Blood, 2009, 114(14):2884-2887.

［5］ sain Askree S, Hjelm LN, Ali Pervaiz M,et al.Allelic dropout can cause false-positive results for Prader-Willi and Angelman syndrome testing.J Mol Diagn. 2011 Jan;13(1):108-12.