硝酸甘油偏头痛模型对大脑即早基因表达的影响及盐酸氟桂利嗪的干预作用

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[摘要] 目的 探讨硝酸甘油偏头痛模型对脑即早基因表达的影响及盐酸氟桂利嗪的干预作用。 方法 健康Wistar大鼠30只，随机分为对照组、偏头痛模型组、治疗组，各组均灌胃给予盐酸氟桂利嗪或等量生理盐水，每日1次，连续7 d，末次给药20 min后，皮下注射生理盐水或硝酸甘油复制实验性偏头痛大鼠模型，于3 h后取材。随机选取大鼠脑片5个视野，进行c-fos 和 c-jun阳性细胞计数，分析每张切片上每个视野的平均灰度。 结果 偏头痛模型组脑组织切片c-fos 和 c-jun阳性细胞数[（30.60±3.78）、（26.50±6.56）]较对照组[（9.10±1.66）、（8.02±2.05）]明显增多（P < 0.01），盐酸氟桂利嗪治疗组c-fos 和 c-jun阳性细胞数[（13.40±3.45）、（14.30±2.88）]较模型组显著减少（P < 0.05）；偏头痛模型组脑组织切片c-fos 和 c-jun阳性细胞灰度[（104.50±13.73）、（84.34±16.92）]较对照组 [（157.05±37.16）、（177.65±34.36）] 显著减弱（P < 0.01）；盐酸氟桂利嗪治疗组c-fos 和 c-jun阳性细胞灰度[（129.18±37.2）、（151.44±43.29）]较模型组明显增强 （P < 0.05）。 结论 硝酸甘油偏头痛动物模型可显著提高c-fos 和 c-jun阳性细胞数，减弱c-fos和c-jun阳性细胞灰度，而盐酸氟桂利嗪可抑制实验性偏头痛动物模型脑内c-fos 和 c-jun的阳性表达，增强c-fos和c-jun阳性细胞灰度。

[关键词] 硝酸甘油；偏头痛；即早基因；氟桂利嗪

[中图分类号] R747.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（c）-0032-03

偏头痛是一类复杂的神经血管性疾病，与遗传基因和环境因素均有关。偏头痛日益成为影响人们日常生活和工作的重要因素。大量研究显示，偏头痛的发病机制与即早基因的过度表达有关。即早基因是细胞接受刺激后短时间内表达的一族基因，是原癌基因的一类。基因组中的正常基因，进行表达时称原癌基因，原癌基因的正常表达产物是跨膜信号转导过程所必需的。原癌基因被第二信使介导的相关过程激活后，数分钟内即可表达，称即早基因，包括c-fos、c-jun及c-myc等，其中c-fos、c-jun是研究中枢神经系统的重要基因。c-fos基因在正常情况下参与细胞的生长、分化、信息传递、学习和记忆等过程[1-2]，c-fos、c-jun基因蛋白可以早期表达脑缺血、癫痫等刺激引起的分子状态下的神经损伤[3-4]。c-fos、c-jun基因蛋白表达可用于评价偏头痛引起的细胞代谢变化及药物的干预作用。本文旨在观察硝酸甘油偏头痛模型对大脑即刻基因表达的影响及盐酸氟桂利嗪的干预作用，为偏头痛的治疗优化筛选提供可靠的 依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年Wistar大鼠60只，体重（250±20）g，购自山东大学医学院动物实验中心。

1.2 药品与试剂

10%水合氯醛（鲁药准字H01080291，产品批号：20110601）；盐酸氟桂利嗪胶囊（西安杨森制药有限公司，批准文号：国药准字H10930003， 产品批号：121119973）；0.9%氯化钠注射液（规格250 mL，山东金洋药业有限公司，国药准字H37021678，产品批号：1295412）。兔抗c-fos、c-jun抗体（北京中杉生物有限公司）；DAB显色液（京博奥森生物工程有限公司）；光学显微镜（德国leica DM4000B）；leica Qwin V3图像分析软件（德国）。

1.3 实验方法

将Wistar大鼠30只，雌雄各半，随机分为对照组、偏头痛模型组、治疗组，每组10只。对照组和偏头痛模型组各灌胃给予生理盐水20 mL/mg；治疗组灌胃给予盐酸氟桂利嗪1.25 mg/kg，每日1次，连续7 d；第15天灌胃20 min后，除对照组皮下注射生理盐水外[5]，其余各组于右肩部皮下注射硝酸甘油（10 mg/kg）复制实验性偏头痛大鼠模型[6]，于建模后3 h取材。

腹腔注射10%水合氯醛（0.06 mL/kg）麻醉大鼠，暴露心脏，穿刺左心室，插管入升主动脉，剪开右心耳，以250 mL生理盐水快速灌注至肝脏变白，以含4%多聚甲醛的PBS（0.1 mol/L，pH 7.4）灌注固定，0.5 h后取出全脑，置入含4%多聚甲醛0.1 mol/L的PBS（pH 7.4，4℃）后固定；8 h后放置于含20%蔗糖的磷酸缓冲液中，待脑组织下沉，进行冰冻切片；根据大鼠脑组织立体定位解剖图谱，将脑组织切成厚30 μm的薄片[7]。将脑片置于37℃正常羊血清工作液封闭中孵育1 h，滴加一抗4℃冰箱孵育过夜；转至室温平衡30 min，PBS冲洗3次×10 min；滴加荧光二抗，37℃避光孵育60 min，PBS冲洗4次×10 min；DAB显色，复染；梯度酒精脱水；二甲苯透明2次，中性树胶封片[8]。

1.4 镜检和图像分析

光镜下，阳性细胞细胞核染色呈现棕黄色，多为圆形或者卵圆形。各组大鼠每张脑片随机选取5个视野，分别对c-fos、c-jun阳性细胞进行计数并利用leica Qwin V3图像分析软件分析其平均灰度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般行为学变化

偏头痛模型组和治疗组于动物造模后30 min左右，出现挠头、耳红等表现，在30～50 min达到高峰，持续2～2.5 h，大鼠逐渐安静。

2.2 氟桂利嗪对实验性偏头痛大鼠脑神经元、神经胶质内c-fos和c-jun阳性细胞数的影响

镜下c-fos、c-jun蛋白染色呈棕褐（黄）色。对照组可见少量阳性细胞，偏头痛模型组c-fos和 c-jun阳性细胞数较对照组明显增多（P < 0.01），治疗组c-fos和c-jun阳性细胞数较偏头痛模型组显著减少（P < 0.05），提示实验性偏头痛动物模型可显著提高c-fos和c-jun阳性细胞数，而盐酸氟桂利嗪可抑制实验性偏头痛动物模型脑内c-fos 和 c-jun的阳性表达。见表1，图1、2。

2.3 氟桂利嗪对实验性偏头痛大鼠脑神经元、神经胶质内c-fos和 c-jun阳性细胞灰度的影响

偏头痛模型组脑神经元、神经胶质内c-fos 和 c-jun阳性细胞灰度较对照组显著减弱（P < 0.01）；治疗组c-fos 和 c-jun阳性细胞灰度较偏头痛模型组明显增强（P < 0.05）。见表1，图1、2。

3 讨论

硝酸甘油偏头痛模型是最常用的偏头痛动物模型。硝酸甘油在体内产生一氧化氮，并通过其扩血管和神经毒性效应诱发实验性偏头痛，与偏头痛的血管扩张学说相吻合，是理想的偏头痛动物模型。

偏头痛急性期治疗主要包括以非甾体类抗炎镇痛药为代表的非特异性治疗和以曲普坦类药物为代表的特异性治疗。非甾体类抗炎镇痛药副作用较大，患者难以耐受，且镇痛效果欠佳，限制了其临床应用。曲普坦类为5-HT1B/1D受体激动剂，有血管收缩作用，可增加心脑血管疾病的发病风险，不主张在先兆期应用此类药。且与麦角胺类相比，用药24 h内头痛消失后复发率曲普坦类更高（15%～40%）[9]，使偏头痛急性期缺乏适宜的药物治疗。患者服用缓解头痛药物的频率超过2 d/周，即应采取预防性治疗。常用预防性药物主要包括β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、抗癫痫药、抗抑郁药和肉毒素等，其中，以氟桂利嗪为代表的钙离子拮抗剂以其疗效确切，副作用小而广为应用。

c-fos和c-jun存在于神经细胞内，参与痛觉信息传递过程，伤害性刺激可诱发其核内表达。近年来c-fos和c-jun广泛应用于偏头痛发病的分子机制和药效学研究[10]。本研究发现，硝酸甘油偏头痛模型可显著提高脑内c-fos和c-jun的阳性表达，而这种阳性表达可被盐酸氟桂利嗪抑制。提示硝酸甘油偏头痛模型的病理变化与偏头痛发病机制相一致，可作为药物药效学观察的理想模型。

[参考文献]

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[5] Kaido T，Kempski O，Heimann A，et al. Cluster analysis of mRNA expression levels identifies multiple sequential patterns following focal cerebral ischemia [J]. Turk Neuro Surg，2012，22（4）：441-447.

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[7] Sorelli C，Creco R，Wang D，et al. Nitroglycerin induces hyperalgesia in rats a time-course study [J]. Eur J Pharmacol，2003，464（2-3）：159.

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[9] 中华医学会疼痛学分会头面痛学组.中国偏头痛诊断治疗指南（2011）[J].中国疼痛医学杂志，2011，17（2）：65-86.

[10] Zhu X，Han Y，Xiong W，et al. Effects of heating coagulation of middle meningeal artery on plasma CGRP level and c-fos expression in migraine rat triggered by nitroglycerin [J]. Neurol Sci，2011，32（4）：589-594.

（收稿日期：2013-03-26 本文编辑：程 铭）