酶解法提取玉米须中总黄酮工艺的优化

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摘要：以乙醇溶液为提取剂，采用纤维素酶酶解的方法从玉米（Zea mays）须中提取总黄酮。设计单因素试验分析了酶用量、酶解温度、酶解时间、pH、乙醇体积分数和料液比等6个因素对玉米须中总黄酮提取率的影响，采用响应面法进一步优化总黄酮提取的工艺条件。结果表明，酶法提取玉米须中总黄酮的最佳工艺条件为每5.0 g干燥的玉米须粉末中加入3.0 g纤维素酶、酶解温度45.00 ℃、酶解时间149.1 min、pH 4.49、体积分数30%的乙醇溶液作为提取溶剂、料液比1∶20（m∶V，g/mL），此条件下玉米须总黄酮的提取率可达0.837%。

关键词：玉米（Zea mays）须；总黄酮；纤维素酶；响应面法

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4333—04

玉米须是玉米（Zea mays）干燥的花柱和柱头，也被称为玉蜀黍蕊、棒子毛等，是玉米的下脚料。中国的玉米产量居于世界领先地位，每年收获玉米的同时会产生大量的玉米须。然而目前仅有少量玉米须被用作传统的中药材，大部分被白白丢弃。玉米须在环境中长期堆放会滋生大量有害的生物，如霉菌、螨类等。对玉米须进行有效的处理，在实现生物资源有效利用的同时减少环境污染是一个亟待解决的课题。

医学上认为玉米须具有显著的利尿、降血糖[1]、抑菌[2]、降压、增强免疫、抗癌的功效[3]，既有明显的药用价值，又具备一定的食疗特征[4]。研究人员已经从玉米须中分离鉴定出了黄酮类、苷类、甾类、生物碱、糖类、有机酸、挥发油、微量元素和维生素等多种活性物质[5]。本试验使用酶解法提取玉米须中的总黄酮，并设计单因素试验考察了酶用量、提取温度、提取时间、pH、乙醇溶液体积分数和料液比等因素对黄酮提取率的影响，并在此基础上采用响应面法对提取工艺进行优化，以最大限度地保持黄酮的稳定性并提高黄酮的得率，为玉米须的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米须为常规型甜玉米花柱头，购买于华中农业大学校门口的集贸市场。选取质地均匀的玉米须，40 ℃干燥、粉碎，过60目筛，保存在阴凉干燥处。

主要试剂亚硝酸钠（上海青析化科技有限公司）、硝酸铝（上海新宝精细化工厂）、氢氧化钠（天津市风船化学试剂科技有限公司）、锌粉（湖南湘中化学试剂采供站）、盐酸（信阳市化学试剂厂）、乙醇（国药集团化学试剂有限公司）均为分析纯；芦丁（上海辰云化工有限公司）、纤维素酶（武汉市华顺生物技术有限公司）。

主要仪器有分光光度计（725型）、天平（FA1104N），上海精密仪器科学有限公司；恒温水浴锅（DF—101s型）、循环水真空泵（SHB—D型），郑州长城仪器厂；旋转蒸发仪（Zfa—84型），上海机械专机厂；植物粉碎机，北京医疗设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 配制0.1 mg/mL的芦丁标准溶液，将其分别稀释至0.016、0.032、0.048、0.064和0.080 mg/mL，在510 nm处检测其吸光度，得到芦丁溶液浓度X（mg/mL）对吸光度A510 nm（Y）的线性回归方程为Y=9.978X+0.002，相关系数为0.999 4。

1.2.2 单因素试验 设置单因素试验分别考察酶用量、酶解温度、酶解时间、pH、乙醇溶液体积分数和料液比对玉米须总黄酮提取率的影响。①酶用量。取5份干燥玉米须粉末5.0 g，加入体积分数75%的乙醇溶液100 mL，酶的用量分别为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g（酶活力单位60 U/g），pH 5.0、45 ℃酶解120 min。②酶解温度。取5份干燥玉米须粉末5.0 g，加入体积分数75%的乙醇溶液100 mL，调节体系pH为5.0，酶用量3.0 g，酶解温度分别为35、40、45、55、60 ℃，酶解时间120 min。③酶解时间。取5份干燥玉米须5.0 g，加入体积分数75%的乙醇溶液100 mL，调节体系pH为5.0，酶用量3.0 g，酶解温度45 ℃，酶解时间分别为60、90、120、150、180 min。④pH。取5份干燥玉米须5.0 g，加入体积分数75%的乙醇溶液100 mL，酶用量3.0 g，调节反应体系pH分别为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5，45 ℃酶解150 min。⑤乙醇溶液体积分数。取5份干燥玉米须5.0 g，分别加入100 mL体积分数为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液，酶用量为3.0 g，pH 4.5、45 ℃酶解150 min。⑥料液比。取5份干燥玉米须5.0 g，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（m∶V，g/L，下同）加入体积分数30%的乙醇溶液，酶用量为3.0 g，pH 4.5、45 ℃酶解150 min。各单因素试验酶解反应完成后迅速升温至90 ℃以上充分灭活10 min，过滤，转移滤液至250 mL容量瓶定容，测定A510 nm，计算总黄酮提取率。

1.2.3 Box—Benhnken响应面试验 根据单因素试验结果以及Box—Benhnken响应面试验设计原理[6]，在酶用量为原料质量的60%、乙醇溶液体积分数30%、料液比1∶20的条件下设计三因素三水平的响应面试验，考察酶解温度、pH和酶解时间对总黄酮提取率的影响，共15个试验点，其中12个为析因点，3个为零点试验。Box—Benhnken试验因素与水平如表1所示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶用量对玉米须总黄酮提取率的影响 玉米须总黄酮的提取率随酶用量的不同而不同（图1），其先随着酶用量的增加而不断上升，酶用量为3.0 g时达到最大，为0.82%；继续增加酶的用量，总黄酮的提取率反而下降，可能的原因是酶的用量较低时其可与玉米须底物充分结合，但当底物不能对酶达到饱和的时候，酶的活性会受到抑制。

2.1.2 酶解温度对玉米须总黄酮提取率的影响 随着酶解温度的升高，玉米须总黄酮的提取率先不断上升，在温度为45 ℃时达到最高，为0.79%；温度再上升，总黄酮的提取率反而下降（图2），可见试验所用酶的最适反应温度为45 ℃。

2.1.3 酶解时间对玉米须总黄酮提取率的影响 随着酶解时间的延长，玉米须总黄酮的提取率先上升，当酶解时间为150 min时提取率达到最大，为0.82%；继续延长酶解时间，总黄酮的提取率反而下降（图3），可能的原因是反应时间过长会导致反应体系中已溶出的总黄酮发生降解。

2.1.4 pH对玉米须总黄酮提取率的影响 随着酶解体系pH的升高，玉米须总黄酮的提取率先不断上升，当pH为4.5时提取率最高，达0.81%；之后pH再上升，总黄酮的提取率反而下降（图4），可见试验所用酶的最适pH为4.5。

2.1.5 乙醇溶液体积分数对玉米须总黄酮提取率的影响 提取剂乙醇溶液的体积分数对玉米须总黄酮提取率有较大的影响。乙醇溶液体积分数过高或过低都会降低总黄酮的提取率（图5）。用体积分数为30%的乙醇溶液作提取溶剂提取率最高，为0.82%。可能的原因是黄酮是醇溶性的，较高的乙醇溶液体积分数有利于黄酮的溶出，但是乙醇溶液体积分数过高会抑制酶的活性。

2.1.6 料液比对玉米须总黄酮提取率的影响 料液比对玉米须总黄酮提取率的影响结果见图6。由图6可知，随着提取剂乙醇溶液的用量增加，总黄酮的提取率先上升，料液比为1∶20时最大，为0.82%；之后再增加溶剂的用量，提取率反而下降。可能的原因是乙醇溶液用量过少时黄酮和酶不能充分溶于溶剂中；而溶剂用量过大会使反应体系中酶的浓度下降，从而降低了提取率。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果与方差分析 Box—Benhnken响应面试验结果见表2。以玉米须总黄酮的提取率为响应值Y，通过SAS软件的RSREG程序对试验数据进行响应面分析（RSA），经二次回归拟合求得响应函数。回归方程为：Y=—24.505 509 +0.427 190X1+5.438 214X2+0.047 106X3—0.004 312X12—0.010 356X1X2

—0.556 502X22 + 0.000 050 X1X3 + 0.000 195 X2X3—

0.000 169X32，其决定系数R2为0.975 2。从表2可以看出，试验结果与预测值十分接近。

回归方程的方差分析结果见表3。模型的F=21.89（P

2.2.2 响应面图形分析 分别固定X1、X2、X3绘制另2个因素之间的响应面图和等高线图（图7—图9），结合响应面图可求解出最佳工艺条件下的特征向量、特征值点坐标及最佳工艺条件下的提取率（表4）。3个因素的特征值均为负，表明此二次响应面有极值存在，可以直接从此二次响应面上找出最佳工艺参数。当特征值X1、X2、X3分别为—0.102 958、—0.142 995、—0.152 632时，临界点（0.000 493，

—0.013 129，—0.031 092）是最大值点。由临界点确定最佳工艺条件为：反应温度45.00 ℃，pH 4.49，酶解时间149.1 min，预测最大提取率为0.836%。在此条件下进行验证试验，总黄酮的提取率为0.837%，与理论值没有显著差异，可见本试验优化得到的乙醇酶解法提取玉米须中总黄酮的工艺条件是可靠的。

3 结论

通过单因素和响应面试验得到优化的酶解法提取玉米须中总黄酮的条件为每5.0 g干燥的玉米须粉末中加入3.0 g纤维素酶、酶解温度45.00 ℃、酶解时间149.1 min、pH 4.49、溶剂乙醇溶液体积分数为30%、料液比1∶20。此条件下玉米须中总黄酮的提取率可达0.837%。以玉米须为原料提取总黄酮，材料来源广泛，提取工艺简单，所得产品稳定性好，具有一定的经济价值和社会效益。

参考文献：

[1] 黄晓巍，卢彤宇，欧喜燕，等. 玉米须总黄酮对糖尿病合并心肌缺血大鼠血糖、心电图及全血黏度的影响[J]. 吉林中医药，2009（12）：1074—1075.

[2] 钟有添，陈玉帅，毛晓洁，等. 玉米须抗菌活性的初步研究[J]. 赣南医学院学报，2008，28（4）：477—478.

[3] 王英平，李向高. 玉米须化学成分和药理作用研究进展[J]. 特产研究，2004（2）：42—46.

[4] 纪丽莲.玉米须的食疗价值与开发[J].中国野生植物资源，1997， 16（3）：24—25.

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