基质金属蛋白酶-7在喉癌中的表达及与肿瘤侵袭转移、血管生成的关系

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【摘要】 目的 观察基质金属蛋白酶-7（MMP-7）蛋白在喉癌中的表达，探讨其表达与肿瘤侵袭转移、血管生成及预后的关系。方法 采用免疫组化方法检测MMP-7在48例喉癌标本中的表达水平，运用χ2检验、直线回归分析、乘积极限法、对数秩检验进行统计学分析。结果 MMP-7在喉癌中的阳性表达率为81．25%（39/48），明显高于癌旁正常喉黏膜上皮的18．75%（6/48）；MMP-7与患者年龄、肿瘤病理分化程度无关，与喉癌原发灶浸润深度、区域淋巴结转移范围和临床分期相关；喉癌MMP-7蛋白表达水平与肿瘤微血管密度呈线性依存关系，其回归系数为0．60；低表达（阴性或弱阳性）MMP-7的喉癌标本术后3年和5年的生存率分别为82．38%、73．23%，明显高于高表达（阳性或强阳性）MMP-7的喉癌标本术后3年和5年的生存率分别为66．42%、44．28%。结论 MMP-7在喉癌中呈阳性表达，其表达与肿瘤侵袭转移程度呈正相关系，与喉癌微血管密度呈线性依存关系，高表达MMP-7的喉癌预后较差。

【关键词】喉肿瘤；基质金属蛋白酶-7；免疫组织化学；肿瘤转移；血管生成；预后

Expression of matrix metalloproteinase-7 in laryngeal carcinoma and its significance in cancer metastasis and Angiogenesis

XU Wei-hua，CHEN Ren-hui,FU Ya-feng,et al.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,The Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,China

【Abstract】 Objective To observe the expression of matrix metalloproteinase-7 (MMP-7) in laryngeal carcinoma and its significance in metastasis angiogenesis and prognosis.Methods Immunochemistry were used to detect the expression of MMP-7 in laryngeal carcinoma.Chi-square test,linear regression,Kaplan-Meier method and log-rank test were applied in statistic analysis.Results Expressive rate of MMP-7 in laryngeal carcinoma was 81．25%,obviously higher than 18．75%in normal laryngeal epithelial.MMP-7 expression was not coherent with patients age and histology classification.But the relationship was existed between MMP-7 expression and laryngeal cancer invasive depth and rational lymphatic metastasis and TNM staging.Linear dependency was exist between MMP-7 expression and tumor microvessel density (MVD).The 3 years and 5 years survival rate of low MMP-7 express (negative or slight positive) laryngeal carcinoma were 82．38%and 73．23%,obviously higher than 66．42%and 44．28%in high express (positive or high positive) group.Conclusion MMP-7 express in laryngeal carcinoma.The expression are related with cancer invasion and metastasis.Linear dependency was exist between MMP-7 expression and tumor MVD.High MMP-7 expression laryngeal carcinoma have a bad prognosis.

【Key words】Laryngeal carcinoma;Matrix Metalloproteinase-7;Immunochemistry;Tumor Metastasis;Angiogenesis;Prognosis

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，较其他头颈部肿瘤，喉癌虽然有较低的转移率，但是局部复发和转移仍为喉癌患者5年内死亡的主要原因[1]。基质金属蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7,MMP-7）作为MMP家族中较为重要的基质降解素，已经发现其表达与消化道等恶性肿瘤的浸润与转移相关[2]。本文检测了MMP-7蛋白在喉癌中表达水平，并探讨其表达与肿瘤侵袭转移、血管生成和预后的关系，旨在发现有预示作用的生物分子指标。现将实验结果报告如下。

1 材料

本实验的48例喉癌标本取自1997年4月至2001年4月我科行手术切除的原发性喉癌患者，所有患者手术前均未接受放射或化学治疗。48例喉癌中，男46例，女2例，平均年龄（58．47±12．58）岁。标本术后均经病理诊断为喉鳞状细胞癌，高、中、低分化癌分别为22、18、8例。以UICC（国际抗癌联盟）1997年TMN分类分期方法为临床分类分期标准[3]，声门上型11例，声门型29例，声门下型8例；Ⅰ期8例，Ⅱ期14例，Ⅲ期18例，Ⅳ期8例，其中T1、T2、T3、T4各12、18、13、5例，N0、N1、N2、N3各26、14、7、1例，无远处转移患者。同时取手术切除标本的癌旁正常喉黏膜上皮为对照组。

2 方法

2．1 免疫组化染色

手术切除标本均用10%甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡后石蜡包埋保存。实验前制成厚4μm连续石蜡切片，采用免疫组化SP法进行切片染色，染色步骤按照试剂盒及一抗说明书要求进行。SP-9000通用试剂盒、鼠抗人MMP-7单克隆抗体、鼠抗人CDsub>34单克隆抗体均购买于北京中杉金桥生物技术有限公司。用PBS液代替一抗作为阴性对照。

2．2 结果判定

由两位观察者采取盲法进行读片。把制好的切片放于显微镜下观察，正常组织取黏膜上3个高倍区域（×200），癌组织选取癌细胞丰富的3个高倍区域（×200）。MMP-7在正常组织中一般不表达，在肿瘤细胞组织中可见细胞浆内棕黄染色，根据计算法[4]评定MMP-7阳性结果。CDsub>34阳性染色的微血管内皮细胞胞浆呈棕黄色，根据改良的Weidner法[5]计算微血管密度（MCV）。

2．3 统计学方法

所有数据录入SAS9．0系统，运用行列表资料χ2检验进行MMP-7表达的组间差异比较、直线回归分析进行相关性分析、乘积极限法（Kaplan-Meier法）描述生存资料，对数秩检验进行组间生存曲线的比较。以P

3 结果

MMP-7蛋白阳性产物定位于细胞胞浆，呈淡黄色、棕黄色、棕褐色不同强度染色。48例喉癌组织中，共有39例表达MMP-7蛋白，阳性表达率为81．25%。而48例癌旁组织中，共有6例表达MMP-7蛋白，且均为弱阳性，其阳性表达率为18．75%。喉癌与癌旁正常喉黏膜上皮MMP-7蛋白的表达率均数差异有统计学意义（χ2=45．55，P

MMP-7 表达与喉癌临床病理特征的关系如表1所示，MMP-7 表达与喉癌患者年龄、病理分化程度无关，与肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移范围及临床分期密切相关。

48例喉癌标本中，阴性、弱阳性、阳性、强阳性表达MMP-7蛋白的喉癌标本的微血管密度分别为18．56±3．81、21．86±4．29、23．08±4．05、27．25±3．41，喉癌MMP-7蛋白表达水平与肿瘤微血管密度呈线性依存关系，其回归系数为0．60（见表2）。

23例低表达（阴性或弱阳性）MMP-7的喉癌标本术后3年和5年的生存率分别为82．38%，73．23%，25例高表达（阳性或强阳性）MMP-7的喉癌标本术后3年和5年的生存率分别为66．42%，44．28%；两组间比较差异有统计学意义（χ2=4．04，P=0．044），说明低表达MMP-7的喉癌患者预后优于高表达组。

4 讨论

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，较之其他头颈肿瘤，喉癌虽然有比较低的转移率，但是局部复发和转移仍为喉癌患者五年内死亡的主要原因[1]。因此寻找喉癌扩散及转移的机制，并制定针对性的干预措施，抑制肿瘤扩散和转移，减少喉癌术后区域复发和远处转移，有重要的临床意义。肿瘤的形成与发展除与细胞自身基因突变所导致的原癌基因激活或抑癌基因失活有关外，还受肿瘤细胞所处微环境变化的影响。细胞外基质（extracellular matrix,ECM）是细胞赖以生存的场所，是维持细胞微环境内稳态的物质基础。近年研究发现，ECM结构及组成成分的变化是其影响细胞功能的重要方式，基质金属蛋白酶家族（MMPs）几乎可以降解ECM的全部组分，因而ECM的变化受MMPs的调节。MMPs是一个不断有新成员加入的庞大家族，当前的研究发现有超过25个成员[6]。MMP-7亦称基质溶解素（matrilysin），由于羧基端缺乏类血红素结合蛋白区，为MMPs中分子量最小的成员。MMP-7主要由纤维母细胞、巨噬细胞、肿瘤细胞分泌，能降解ECM的弹性蛋白、明胶、Ⅳ型胶原纤维、层黏素（LM）、纤维蛋白（FN）等多种成分，为肿瘤细胞扩散提供通道，并通过打破肿瘤细胞间牢固的黏附作用，而促使肿瘤细胞游走，脱离原发瘤而进入周围组织和血管[7]。

我们通过喉癌组织切片的免疫组化实验，观察到MMP-7蛋白主要表达于肿瘤细胞，小部分位于肿瘤浸润边缘的间质中，并以癌巢扩散前沿（invasive front）的肿瘤细胞表达最为明显，其在喉癌原发灶中浸润前沿的癌细胞MMP-7蛋白的表达量明显高于癌巢中心区域。这与Zheng等[8]和Liu 等[9]在胃癌的研究结果相同。运用行列表资料χ2检验的关联性分析，结果提示MMP-7蛋白表达与喉癌患者年龄无关（χ2=2．46，P>0．05），不同病理分化程度的喉癌标本MMP-7蛋白表达的差异无统计学意义（χ2=6．36，P>0．05）。不同浸润深度、区域淋巴结转移范围和临床分期的喉癌标本之间MMP-7蛋白表达水平的差异有统计学意义（其相应的χ2值为9．89、14．76、10．57，均P

近年来的研究结果还提示，MMP-7还通过影响肿瘤血管生成（angiogenesis）而促进肿瘤侵袭和转移。首先，MMP-7对ECM的降解为新生血管的生长扩散、进入癌巢打开了“缺口”。其次，通过原位杂交技术和免疫组化分析已经证实阳性表达MMP-7的肿瘤细胞周围的血管内皮细胞表达MMP-7的mRNA和蛋白[10]，同时体外培养结果表明MMP-7可以促进脐静脉内皮细胞的增殖[11]，这些结果都提示MMP-7直接参与肿瘤血管生成过程。我们以CDsub>34蛋白染色为血管内皮细胞的标记，计数喉癌组织的微血管密度，结果阴性、弱阳性、阳性及强阳性表达MMP-7蛋白的喉癌标本微血管密度分别为18．56±3．81、21．86±4．29、23．08±4．05、27．25±3．41，MMP-7蛋白的表达水平与微血管密度呈线性依存关系，其回归系数为0．60，说明MMP-7蛋白的表达水平促进喉癌肿瘤血管的生成。

以上的实验证实MMP-7蛋白的表达与喉癌侵袭转移、肿瘤血管形成密切相关，表明高表达MMP-7蛋白的喉癌有更强的恶性能力。基此，我们对高表达（阳性或强阳性）MMP-7蛋白和低表达（阴性或弱阳性）MMP-7蛋白的两组喉癌患者的生存资料进行分析，结果高表达MMP-7蛋白的喉癌患者术后3年和5年的生存率分别为66．42%和44．28%，明显低于低表达MMP-7的喉癌标本的82．38%和73．23%，两组间比较差异有统计学意义（χ2=4．04，P

参考文献

1 季文樾,杜强,关超,等.1115例喉癌患者的生存分析.中华耳鼻咽喉科杂志,2004,39(1)：17-19.

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3 屠规益.喉癌下咽癌理论与临床.山东科学技术出版社,2002：47-49.

4 夏铁安.肿瘤相关抗测定//见：夏同礼.肿瘤特检诊断.人民卫生出版社,2002：98.

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7 Nemori R,Yamamoto M,Kataoka F,Hashimoto G,Arakatsu H,Shiomi T,Okada Y.Development of in situ zymography to localize active matrix metalloproteinase-7 (matrilysin-1).J Histochem Cytochem,2005,53：1227-1234.

8 Zheng HC,Sun JM,Li XH,et al.Role of PTEN and MMP-7 expression in growth,invasion,metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma.Pathol Int,2003,53(10)：659-666.

9 Liu XP,Kawauchi S,Oga A,et al.Prognostic significance of matrix metallop-roteinase 7(MMP-7) expression at the invasive front in gastric carcinoma.Jpn J Cancer Res,2002,93(3)：291-295.

10 Nagashima Y,Hasegawa S,Koshikawa N,et al.Expression of matrilysin in vascular endothelial cells adjacent to matrilysin-producing tumors.Int J Cancer,1997,72：441-445.

11 Huo N,Ichikawa Y,Kamiyama M,et al.MMP-7 (matrilysin) accelerated growth of human umbilical vein endothelial cells.Cancer Lett,2002,177：95-100.