高黎贡山土壤低温淀粉酶产生菌的筛选

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摘要：为获取工业生产上有潜在应用价值的低温淀粉酶产生菌，从高黎贡山百花岭南斋公房采集的土样中定向筛选得到10株产淀粉酶菌株，选择其中透明圈有效值最大的GD-6菌株进行摇瓶发酵。结果表明，该菌株最适产酶温度为20 ℃， 最佳产酶pH 为7.0，160 r/min摇瓶培养24 h后，产酶活性为420.9 IU/（mL・min）。

关键词：高黎贡山；低温淀粉酶产生菌；筛选；酶活性

中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）04-0784-03

Screening of Cold-Active Amylase-Producing Strain from Soil in Gongshan of Gaoli

YU Li，YAN Ai-fen

（Department of Resources and Environment， Baoshan University， Baoshan 678000， Yunnan，China）

Abstract： In order to obtain cold-active amylase-producing strain with potential value for industrial production， 10 amylase-producing strains were isolated from Southern Zhaigongfang of Gongshan in GaoLi. The strain， GD-6， which had effective value for maximum of transparent circle， was chose to ferment. The results showed that the optimal enzyme-producing condition of this strain was as follows： 20 ℃， pH 7.0， 160 r/min shake flask for 24 h. Under this optimal condition， the amylase activity was 420.9 IU/（mL・min）.

Key words： Gongshan of Gaoli； cold-active amylase-producing strain； screening； enzyme activity

淀粉酶是能催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其他低聚糖的一群酶的总称[1]。低温淀粉酶是一个相对的概念，其最适作用温度比嗜温淀粉酶要低20～30 ℃，而且在0 ℃有一定的酶活性。由于低温淀粉酶具有在低温下有效发挥催化作用的特点，使其在生物工程领域及解决现代能源危机中有着广泛的应用前景[2]。有研究者从黄海、东海海底淤泥样品中分离出低温淀粉酶菌株Penicillum sp. FS010441，并对其进行了研究[3]。作者通过对高黎贡山高海拔地区土样进行定向分离筛选研究，得到10株具有产淀粉酶能力菌株，对其中一株产酶能力较好的菌株进行了产酶条件的初步研究，以期筛选出工业生产上有潜在应用价值的低温淀粉酶菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品 土壤样品采自高黎贡山百花岭南斋公房（海拔3 150 m）。

1.1.2 培养基 富集培养基。可溶性淀粉2 g/L，蛋白胨1 g/L，牛肉膏0.5 g/L，NH4NO3 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4・7H2O 0.5 g/L，FeSO4・7H2O 0.01 g/L，KCl 0.5 g/L，自然pH。固体平板分离培养基。可溶性淀粉2 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO4 3 g/L，FeSO4・7H2O微量，MgSO4・7H2O 微量，琼脂15 g/L，pH 7.0。该培养基不加琼脂作为发酵培养基，分装于250 mL三角瓶内，每瓶100 mL。

1.1.3 试剂 DNS试剂（二硝基水杨酸试剂）。用比色定糖法测定酶解液中还原糖的含量以测定酶活性。称取酒石酸钠22.75 g溶于125 mL水中，于溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸0.875 g，氢氧化钠 5 g，加热溶解，再加入重蒸酚0.625 g，无水亚硫酸钠0.625 g，搅拌使之溶解，冷却后定容至250 mL，放于棕色瓶中，放置7 d后使用[4]。500 μg/mL标准葡萄糖溶液。称取105 ℃干燥2 h的分析纯葡萄糖0.125 g，加水溶解，稀释定容至250 mL。柠檬酸缓冲液。以0.1 mol/L的柠檬酸溶液和0.1 mol/L的柠檬酸三钠溶液按比例混合，配制不同pH的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液，用于1%淀粉溶液配制和酶活性测定。卢哥（Lugol）氏碘液。卢哥（Lugol）氏碘液按文献[5]的方法配制。1%的淀粉溶液。1 g可溶性淀粉加入2.5 mL水溶解，再加35 mL沸水煮沸2 min，使其冷却加入25%的柠檬酸钠缓冲溶液至100 mL，作为酶活性测定的底物[6]。

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶产生菌的分离筛选方法 称取土壤样品10 g置于装有90 mL无菌水的三角瓶中，剧烈振荡10 min使样品颗粒分散均匀。静置5 min，取悬液10 mL置于装有100 mL富集培养基的三角瓶中（3瓶重复）。37℃摇瓶培养3 d后，取培养液0.1 mL涂布培养于固体平板分离培养基中，37 ℃ 恒温箱培养。菌体生长后，用卢哥氏碘液判断是否有淀粉分解，通过测量透明圈大小，初步判断水解淀粉的能力，挑取透明圈直径（D）与菌落直径（d）比值较大的菌落进一步分离纯化，将纯化后的单菌落保存于营养琼脂斜面培养基中。

1.2.2 菌株发酵条件确定和粗酶液的提取 将纯化后的菌株活化后制成菌悬液，以2%接种量接入发酵培养基中，分别考查菌株在温度5、10、15、20、25、30、35、40 ℃和pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下的产酶情况，160 r/min摇床培养24 h，以确定适宜的产酶发酵温度和pH。发酵结束后直接用发酵液作为粗酶液用于酶活性测定。

1.2.3 DNS 法制作标准曲线 标准曲线的制作参考文献[7]的方法，以葡萄糖作为标准溶液。

1.2.4 低温淀粉酶活性的测定方法 取0.5 mL发酵液加入1 mL 1%的淀粉溶液使两者充分混合后37 ℃水浴5 min，再把该混合液煮沸5 min，终止反应，再加入1 mL DNS，沸水浴5 min后迅速冷却，加水2.5 mL，用723型分光光度计在波长620 nm 处测定吸光度。以发酵液加1%淀粉溶液直接煮沸再加DNS试剂反应作为空白对照[6]。

酶活性定义：在37 ℃，1 mL酶底物反应液1 min内产生相当于1 μg/mL葡萄糖的还原糖量规定为1个酶活性国际单位（1IU）。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离筛选结果

利用筛选培养基从土壤样品中初步分离获得产淀粉酶的菌株10株，初步筛选出D/d大于2的6株产淀粉酶能力较强的菌株（表1）。由表1可见，GD-6菌株的D/d最大，其次是GD-3、GD-4菌株，D/d大表明该菌株产生的淀粉酶分解淀粉能力强，由此初步确定GD-6菌株产淀粉酶能力最强。故以该菌株为试验菌株进行产酶条件及酶活性研究。

2.2 葡萄糖标准曲线的绘制结果

用不同葡萄糖浓度与DNS共热反应显色后，测出其在620 nm处的吸光度，作出标准曲线（图1）。得出回归方程■=1.531 3x-0.327 5，用于酶活性的测定。

根据标准曲线和计算公式得：还原糖量（μg/mL）=[（OD620 nm+0.307 5）/1.151 3]×1 000，则酶活性=还原糖浓度/[作用时间（5 min）×粗酶液（0.5 mL）]

2.3 最适产酶温度的确定结果

利用GD-6菌株分别在10、15、20、25、30、35、 40 ℃下，pH 7.0，160 r/min摇瓶发酵培养24 h后，以发酵液作为粗酶液进行低温淀粉酶活性测定，然后在波长620nm处进行吸光度测定并计算酶活性。反应温度对酶活性的影响见图2。由图2可知， GD-6菌株最适产酶温度为20 ℃，在20 ℃条件下培养产酶活性可达420.9 IU/（mL・min），产酶能力最强。

2.4 最适产酶pH的确定

在酶活性测定反应体系中，在最适作用温度（20 ℃）下，利用GD-6分别在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0条件下进行发酵培养，以发酵液作为粗酶液进行酶活性测定，在波长620 nm处进行吸光度测定并计算酶活性。pH对酶活性的影响见图3。由图3可知，GD-6菌株所产淀粉酶的活性在20 ℃、pH 7.0的培养条件下最高，为420.6 IU/（mL・min）。

3 结论

高黎贡山百花岭南斋公房海拔3 150 m，年平均气温在15 ℃左右，最低气温为达-6 ℃，属高海拔高寒地区，有利于低温微生物的生长。通过对该地区土样的研究，得到了6株产淀粉酶能力较强的菌株，编号为GD-1、GD-2、GD-3、GD-4、GD-5、GD-6；通过比较透明圈有效值的大小初步判断产酶活性，选取GD-6为研究菌株进行低温下产淀粉酶能力的研究。最终确定GD-6菌株最适产酶温度为20 ℃，最适产酶pH 7.0，160 r/min摇瓶培养24 h后，酶活性可达420.9 IU/（mL・min）。

参考文献：

[1] 胡学智.国内外酶制剂工业及其应用[J].工业微生物，2001， 31（3）：41-46.

[2] 曹军卫，沈 萍，李朝阳.嗜极微生物[M].武汉：武汉大学出版社，2004.

[3] 吴 虹，郑惠平.低温微生物适应低温的分子机制[J].生命的化学，2001（21）：163-165.

[4] 包 ，王晓辉，张伟琼，等.纤维素分解菌的选育及酶活测定[J].生物学杂志，2007，24（2）：56-58.

[5] 李振高，骆永明，滕 应.土壤与环境微生物研究法[M].北京：科学出版社，2008.

[6] 史永旭，姜永明.五种淀粉酶活方法的比较研究[J]. 微生物学报，1996，23（6）：371-373.

[7] 肖 湘，周 樱，王凤平.高效几丁质降解菌的分离、鉴定及其几丁质酶系的研究[J].海洋学报，2003，25（1）：138-142.