几种银杏类制剂中银杏酸的高效液相色谱法测定

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【摘要】 采用正己烷提取， 薄层色谱纯化， 高效液相色谱法（HPLC）检测并考察几种银杏类制剂总银杏酸的含量。色谱条件为Hypersil ODS C-18（150 mm×4.6 mm， 5 ?m）；流动相组成为甲醇-3% HAc溶液（92：8， V/V）， 紫外检测波长306 nm， 流速1.0 ml/ min， 柱温40℃， 进样量：20 ?l， 外标法计算含量。结果表明：总银杏酸线性回归方程为：Y=4998X-100492， r2=0.9986， 线性关系良好。标准品和样品的相对标准偏差RSD均为0.38%， 表明仪器精密度良好。7种银杏产品中， 采摘的新鲜银杏叶中总银杏酸的含量接近于1%， 其余6种市场上的银杏制剂总银杏酸含量均较大程度超过10 ppm。其中， 这一研究结果为正确使用银杏叶产品提供了参考。

【关键词】 银杏类制剂；银杏酸；高效液相色谱法

近年来， 各种银杏类制剂如银杏茶、银杏片、银杏胶囊、银杏注射液因含有较高的总黄酮醇苷、萜类内酯等， 具有降血糖， 软化血管等功效， 逐渐广泛使用于治疗心脑血管类疾病。但同时还含有一类有毒成分银杏酸， 具有致敏性[1， 2]、细胞毒性[3， 4]和免疫毒性[5]等作用， 其食用安全性已引起人们的高度重视。按照《中国药典2010版》对银杏叶药材的质量标准规定， 有效成分总黄酮不得少于0.4%、银杏总内酯不得少于0.25%。对其毒性成分总银杏酸的含量不得超过百万分之十。从药品安全性角度考虑， 德国Schwabe公司1991年专利中提出银杏酸类化合物含量要求低于10 mg/kg， 德国卫生部1997年提出银杏酸含量应低于5 mg/kg[6]。基于此， 本实验从市面上购买了几种不同的银杏产品， 采用正己烷提取， 薄层色谱纯化， HPLC法检测考察其中银杏酸的含量。

1 材料与方法

1. 1 材料 银杏叶片a（样品1）、银杏叶片b（样品2）、银杏胶囊a（样品3）、银杏胶囊b（样品4）、银杏茶a（样品5）、银杏茶b（样品6）：市售。银杏叶（样品7）采集于湖南城市学院校园， 树龄4～5年， 于太阳下暴晒至干， 存于密封容器中备用（经测定含水率为11.75%）， 银杏酸标准品：上海江莱生物科技有限公司， 并提供了银杏酸的组成和含量（C13：0， 6.2%；C15：1， 32.22%；C17：2， 1.54%；C15：0， 1.14%；C17：1， 12.474%）， 纯度>99%。甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、石油醚：色谱纯；超纯水。

1. 2 实验仪器 FC-104型电子天平（万分之一）：上海精密仪器有限公司；索氏提取仪：上海洪纪仪器设备有限公司；LC-10AT 型高效液相色谱仪：日本岛津有限公司；U-3010型紫外可见分光光度计：日本岛津有限公司；RE-2000A 型旋转蒸发仪：上海雅荣生化设备仪器有限公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 银杏酸标准品溶液的制备 准确称取5 mg银杏酸A与10 mg银杏酸B用色谱纯甲醇溶解定容至100 ml， 得浓度为150 ?g/ml的银杏酸对照品溶液。分别准确移取6.00、7.00、8.00、9.00、10.00 ml银杏酸对照品溶液用甲醇稀释定容至10 ml得浓度为90、105、120、135、150 ?g/ml银杏酸标准溶液。分别吸取20 ?L系列浓度的银杏酸标准溶液进样， 测定C13：0、C15：1、C17：2、C15：0、C17：1的峰面积并加和， 以浓度X为横坐标、总峰面积值Y为纵坐标绘制标准曲线， 并进行线性回归， 得回归方程。

1. 2. 2 样品溶液的制备 由于5种样品中的银杏酸含量差异较大， 故采用了不同的处理方式制备样品溶液。

样品1～6的制备方法[7]：将样品干燥后粉碎， 分别称取20 g粉末（银杏胶囊则取胶囊内粉末）， 加入3000 ml经正己烷于85℃下索氏提取10 h， 收集正己烷提取溶液在40℃减压浓缩至干， 用正己烷定容至1 ml。

样品7的制备方法[7]：将银杏叶干燥后粉碎， 称取2 g粉末， 加入300 ml经正己烷于85℃下索氏提取10 h， 收集正己烷提取溶液在40 ℃减压浓缩至干， 用正己烷定容至10 ml。

其余步骤相同[8]：采用微量注射器吸取0.5 ml样品溶液在薄层板上进行条状点样， 展开剂（石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸=18：1：1）展开后， 置于三用紫外仪254 nm下， 选取蓝色荧光部分物质进行甲醇洗脱， 定容至5 ml， 微孔滤膜过滤后上机进样分析。再根据样品溶液中银杏酸的浓度确定溶液适度的稀释倍数。

1. 2. 3 色谱分析条件 根据文献[7]报道， 银杏酸分析的流动相组成为甲醇-3% HAc溶液（92：8， V/V）；色谱柱：Hypersil ODS C-18（150 mm×4.6 mm， 5 ?m）；紫外检测波长306 nm， 流速1.0 ml/min， 柱温40℃， 进样量：20 ?l。色谱数据处理系统为N2000型色谱工作站， 浙江大学智能信息研究所研制。

1. 2. 4 精密度实验 在上述色谱条件下， 分别取150 ?g/ml的银杏酸标准品及样品1提取液注入液相色谱仪， 每次进样20 ?l， 连续进样5次， 获得峰面积， 计算相对标准偏差RSD。

1. 2. 5 加标回收率的测定 加标回收率的测定：采用加标回收法， 准确吸取4 ml 150 ?g/ml的银杏酸标准品溶液及5 ml浓度为100 ?g/ml银杏样品提取液至容量瓶中摇匀， 定容至10 ml， 进样20 ?l， 平行实验5次， 测平均回收率。

2 结果

2. 1 检测波长的选择 准确移取150 ?g/ml的银杏酸对照溶液2 ml于10 ml容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度线， 以甲醇溶液作为参比溶液， 用紫外-可见光分光光度计在200～600 nm扫描， 得到其吸收光谱曲线如图1（实践）所示， 吸收波长为306 nm。准确移取样品7提取液1 ml置于10 ml容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度线， 准确移取1 ml置于10 ml容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度线， 以甲醇溶液作为参比溶液， 得到其吸收光谱曲线如图1（虚线）所示， 与银杏酸对照品的光谱图基本一致， 因此选择306 nm作为测定波长。

2. 2 色谱条件对银杏酸分析效果的影响 按照1.2.2检测条件测得的银杏酸标准品的出峰如图2所示， 说明该条件下5种银杏酸所有的峰都完全分离， 分离度较好。其出峰顺序分别为C13：0、C15：1、C17：2、C15：0、C17：1， 出峰时间分别为10.948、11.882、13.765、17.365、18.665 min， 由于C17：1存在同分异构体， 在图中有小的肩峰。

2. 3 银杏酸外标曲线的确定 按照“2.2.3”的方法得到的总银杏酸线性回归方程为：Y=4998X-100492， r2=0.9986。线性关系良好。见图3。

2. 4 精密度测定

标准品和样品的相对标准偏差RSD均为0.38%， 表明仪器精密度良好。见表1。

2. 5 样品中银杏酸含量及加标回收率的测定， 见表2。

3 讨论

目前， 国际公认标准为人用治疗剂量中， 总银杏酸的允许最大摄入量为600～1200 ?g/d[9]。银杏叶片及银杏胶囊的产品规格一般为0.2～0.5 g/片， 每日用量一般为3～6片/粒， 根据表2中的银杏酸含量计算， 因此银杏酸的日摄入量为均

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[收稿日期：2014-09-05]