内生细菌YBS106菌株发酵条件优化①

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摘 要：对一把伞南星内生细菌ybs106发酵条件进行研究，确定其最佳发酵液培养基配方和最佳发酵条件。通过杯碟法测定YBS106发酵液对棉花枯萎病原菌的抑菌作用，研究了该菌株在不同培养基，不同生长条件下的代谢产物活性。菌株YBS106的最佳生长条件为：pH7.0，28℃，发酵72 h，接种量4%，床转速为200 r/min。在最佳培养条件下，该菌株对棉花枯萎病菌的抑菌率可达56%。

关键词：内生细菌 棉花枯萎病 发酵条件 抑菌

中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）02（c）-0140-02

Abstract：Study the fermentation conditions of a kind of endophytic bacteria YBS106 which was isolated from Arisaema erubescens in Emei Mount. to optimize the culture medium ingredients and the fermentation conditions. Use cylinder plate method to determine the antifungal activity of YBS106 fermenting solution against Fusarium oxysporum. It was shown that the optimal culture conditions were：medium initial pH 6.0， temperature 28℃， the inoculation 4%， cultivation time 72 h with 200 r/min rotating speed. Under the optimum fermenting solution and culture conditions， the inhibition ratio of YBS106 fermenting solution against F. oxysporum can reach to 56%.

KeyWords：Endophytic Bacteria；Fusarium Oxysporum；Fermentation Condition；Bacteriostasis

棉花枯萎病（Fusarium oxysporum）是一种由棉花尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium f. sp. vasinfectum）引起的、具有毁灭性的土传棉花病害，在外界环境条件有利于枯萎病发生的情况下可引起棉花大幅度减产[1]。通过生物防治方法减少或抑制土壤中病菌接种体数量或致病活性，在小麦全蚀病等土传病害防治中已有成功报道[2]。利用生防措施来控制棉花枯萎病为广大科研工作者所期望，但目前为止尚缺乏高效稳定的生防菌株。内生细菌是一类生长在植物组织细胞间隙的微生物，其中部分内生菌能够产生与宿主相关的活性成分，是生防微生物的重要来源。

本课题组从一把伞南星（Arisaema erubescens （Wall.） Schott）组织中分离到一株对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus， MRSA）和F. oxysporium具有高拮抗活性的内生细菌YBS106，同时也能诱导棉花产生系统抗性。

对微生物发酵工艺的优化主要包括初始条件的选择，培养基的组成配比及培养条件的优化几个方面[3]。本研究旨在对棉花枯萎病菌有拮抗作用的内生细菌YBS106的发酵工艺条件进行优化，以期为棉花枯萎病的防治提供新的方法和途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

S. marcescens YBS106由本课题组从A. erubescen中分离获得，棉花枯萎病致病菌（F. oxysporum）从感病棉花植株中分离获得。

1.2 培养基

营养琼脂培养基NA、营养肉汤培养基NB、马铃薯葡萄糖培养基PDA和葡萄糖铵盐培养基配方参考《植病研究法》[4]。

1.3 菌种培养方法及拮抗活性测定

拮抗细菌的发酵培养：先将保存在斜面上的菌种接入NA培养基平板表面进行活化，然后将其接入到装有100 ml作为种子培养基的500 ml三角瓶中，在30℃、转速为180 r/min条件下培养72 h，再将然后将种子液按1%的接种量转接到10个装有100 mlNB培养基的500 ml三角瓶中，以200 r/min的转速振荡培养72 h。

病原菌平板的制备：用打孔器从培养5 d的棉花枯萎病菌平板上打成直径0.8 mm的菌饼，接到PDA培养的平板上，28℃恒温箱培养48 h。

抑菌活性的测定：采用标准杯碟法[4]测定拮抗菌的抑菌率。将培养48 h的长有棉花枯萎病菌的PDA平板上放置牛津杯，向其中加入200 μl细菌发酵液，静置30 min后，置于24℃恒温箱培养，2 d后观察抑菌结果。用直尺测量棉花枯萎病原菌直径，以自然生长的枯萎病原菌为对照，按照两者比例的大小来比较抑菌活性的大小：内生细菌对棉花枯萎病菌的相对抑菌率计算如下：相对抑菌率=（对照组病原真菌直径-试验组病原真菌直径）/对照组病原真菌直径×100%[5]。

1.4 生长曲线的测定及接种量、最佳发酵时间的优化

生长曲线的测定：用比浊法[6]测出最佳检测波长，结果显示在540 nm有最大吸收。准确吸取培养24 h的YBS106培养液5ml，注入到含有100ml种子培养基的500 ml三角瓶中，振荡并充分摇匀，每隔2 h取少许发酵液，并用无菌水稀释10倍，用分光光度计测量其光密度值OD540[7]。以培养时间为横坐标，OD540值为纵坐标，绘制生长曲线。

最佳接种量的选择：将接种量（体积分数）分别调节为1%、2%、4%、5%、6%、8%，分别接入到液体葡萄糖铵盐培养基中进行培养1 d，再用杯碟法测定发酵液抑菌率。

最佳发酵时间的优化：将YBS106菌悬液以2%接种量接种到液体葡萄糖铵盐培养基中，在pH为7.0，28℃，条件下培养，每隔12 h取样再用杯碟法测定发酵液抑菌率[8]。

1.5 最佳培养条件筛选

培养基初始pH分别为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0，每个梯度设三个重复；培养温度分别为20℃、25℃、28℃、32℃、37℃、42℃下恒温培养72 h，每个温度设三个重复；摇床转速分别为120、150、180、210、240 r・min-1，每个梯度设三个重复。分别进行温度、培养基初始pH和摇床转速单因素试验[10]培养YBS106，采用标准杯碟法测定不同培养条件下拮抗菌的抑菌活性，在培养48 h的长有棉花枯萎病菌的PDA平板上放置牛津杯，向其中加入200μl细菌发酵液，静置30min后，置于24℃恒温箱培养，2 d后观察抑菌结果。

2 结果与分析

2.1 初始条件的选择

菌株YBS106菌液的吸光度值随时间变化的趋势与发酵产物的积累有一定的正相关系，将吸光度值与发酵时间进行线性回归，得到回归方程为Y=0.1202x+0.41，可以用菌液的吸光度值来表示该菌株的生长曲线，根据其变化值判断菌体的生长阶段，掌握控制发酵时间。拮抗细菌YBS106生长曲线见图1。由图1可以看出菌株YBS106的生长曲线较明显地分为以下四个阶段：调整期、对数生长期、稳定期、衰亡期。3～15 h的种子培养液正处于对数生长期，这时菌体生长速率最快，最适于作为种子液，适宜选用12～15 h的发酵液作为种子液。

接种量对抑菌活性有一定影响，随着接种量的增加，抑菌活性先提高，之后逐渐趋于平稳，接种量在4%以上效果不显著（见图2）。

发酵时间对抑菌活性有一定影响，随着发酵时间延长，抑菌活性先升高，发酵72 h后抑菌活性趋于平稳，之后菌液抑菌效果不显著（图3）。

2.2 最佳发酵条件的优化

培养基初始pH：pH是影响YBS106生长的重要因素，在实验的pH范围内，随着pH的上升，抑菌活性逐渐增强，当pH在6.5～7.5之间生长良好，当pH达到7.0附近时活性最高，之后随着pH上升，活性开始下降（见图4）。

培养温度：培养温度也是影响YBS106生长的重要因素，随着实验温度的上升，抑菌活性逐渐提高，到28°C附近时抑菌活性最高，之后随着温度的升高，抑菌活性逐渐降低（见图5）。

摇床转速：摇床转速对YBS106的生长也有影响，在设定的摇床范围内当床转数为210 r/min左右时，抑菌活性相对较高（见图6）。进一步将摇床转速调整为190、200、210、220、230 r/min，结果表明当摇床转速为200 r/min时，抑菌活性最高（见图7）。

从以上实验结果可知，YBS106的最佳发酵条件为初始pH7.0，28°C左右，发酵72 h，接种量4%，床转速为200 r/min。在此条件下测试对抑菌活性的影响，抑菌率为56%。

3 结论与讨论

本研究选取抑菌效果较好的YBS106作为实验菌株对抗菌物质产生条件进行了初步摸索。通过对该菌生长曲线的研究表明，3～15 h的种子培养基正处于对数生长期，最适于做种子液。并且通过对培养基、发酵时间及发酵温度几个条件的研究发现，YBS106在培养基中28℃摇床恒温培养48h后抑菌效果最好。另外通过对培养基的初始pH进行调节发现，培养基的初始pH也会对抑菌效果产生重要影响。初始pH在中性条件下抑菌效果最好，强酸强碱都会导致抑菌效果的下降。这一结果以期为菌株YBS106的开发利用奠定基础。

参考文献

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