猪2型圆环病毒福建株的分离与鉴定

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摘要根据猪圆环病毒GenBank中登录的猪圆环病毒2型（PCV2）特征，设计引物对福建省某地疑似PCV2感染病例进行检测。对阳性病料进行猪圆环病毒分离鉴定，得到一株PCV2，命名为FJ11株。

关键词猪2型圆环病毒；分离；鉴定

中图分类号S852.3文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）22-0320-01

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属圆环病毒科圆环病毒属，是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，粒子直径为17～20 nm，呈20面体对称，为无囊膜单股环状DNA病毒。组成成分为衣壳蛋白和核酸。根据PCV的抗原性、致病性及核苷酸序列的差异，可划分为PCV1和PCV2 2种基因型[1]。其中，PCV1广泛存在于猪体和猪源细胞系，但无致病性。PVC2是导致断奶猪多系统综合征（PMWS）的主要病原。该病自1997年由加拿大首次报道以来，已在许多国家出现感染和流行[2]。Tischer等[3]首先在PK-15细胞中发现并分离PCV（1型），Ellis等通过PK-15细胞从患PMWS的猪体内分离到PCV2病毒。该研究对福建某地疑似感染PMWS的猪场进行PCV2的PCR检测，利用PK-15细胞将阳性病料进行猪圆环病毒分离鉴定，得到一株PCV2，将其命名为FJ11株。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试试剂。大肠杆菌DH5α感受态细胞（自制）；DNA核酸提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒、Taq master Mix（2×）（购自Omega公司）；分析纯（商业公司购买）。

1.1.2供试病料。试验病料来自福建某疑似PMWS猪场。

1.2试验方法

1.2.1病料采集。将组织匀浆后以无菌PBS（pH值7.4）按1∶5的比例进行稀释，后反复冻融3次，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，取上清备用。

1.2.2病毒基因组DNA的提取。参考Omega DNA核酸提取试剂盒方法。

1.2.3引物设计。参考GenBank中登录的所有猪圆环病毒序列，设计1对引物并交由上海生工生物工程有限公司合成，扩增的目的片段大小约为600 nt。引物序列为：PCV1F：5′-TGGGTCTTCACAATTAACAATC-3′；PCV1FR：5′-CAGCC ACCCGTAAAAGTCGT-3′。

1.2.4目的片段的PCR扩增和序列测定。PCR采用50 μL体系：终体积50 μL，Taq master Mix（2×）25 μL、20 pmol/L上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL，剩余部分由双蒸水补充。反应条件：94 ℃预变性5 min，随后进行94 ℃ 50 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s循环，35个循环后，72 ℃延伸7 min。反应结束后，检测扩增效果（1.5%琼脂糖凝胶电泳）。将PCR产物经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用双酶切和PCR方法鉴定重组质粒，将阳性重组质粒交由上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.5病毒分离。将病料上清经0.22 μm过滤除菌后接种处于对数生长期的PK-15细胞（弃去生长液），5%CO2 37 ℃孵育2 h后，加入维持液，继续培养72 h。连续传代5次后，将细胞反复冻融3次，收获病毒液。用DNA核酸提取试剂盒提取细胞的总DNA，用设计的引物进行PCR鉴定。

2结果与分析

2.1PCR扩增结果

对疑似病料的PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，可见在约600 nt的位置出现目的条带，与预期结果相符。将PCV2检测阳性的组织匀浆后接种PK-15细胞后进行连续传代，对第5代收获的病毒液进行PCR检测，可见在约600 nt的位置出现目的条带。结果表明，分离到一株PCV2病毒，命名为FJ11株。

2.2测序结果

2.2.1核苷酸同源性比较。应用DNA Star（By Clustal W Method MegAlign Phylogenetic Tree）软件分析整理，所获得的序列长度为610 nt，与GenBank登录的猪圆环病毒相关序列进行核苷酸同源性比较。结果表明，与BJ0804分离株同源性最高，达98.7%，与SD-6分离株同源性较低，为97.9%。

2.2.2遗传进化分析。应用DNA Star软件，将拼接后的基因序列与GenBank中下载5株我国不同分离地PCV2（BJ0804、GZ0604、PCV2SH0822、SD-6和GS）进行遗传进化分析。结果表明，该研究所分离到的病毒为PCV2。

3结论与讨论

经病原学和血清学调查，证实PCV2广泛存在于世界各地的猪群中，但单一PCV2感染并不会引起明显的临床症状，只会破坏猪体免疫系统，形成免疫抑制作用，从而增强对其他多种病原体的易感性，使动物群体发生难以控制的复发性疾病和多重感染，如猪呼吸道综合征（PRDC）、仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎与肾炎综合征（PDNS）等。目前，PCV2在我国猪群中的流行亦十分严重，并且由于对PCV2流行毒株的变异、基因型、遗传与衍化等分子流行病学的研究尚不完全[3]，临床上常与猪高致病性蓝耳病混合感染，给养猪业造成重大经济损失[4]。

通过对疑似PMWS的猪场病料进行PCR检测，并对阳性病料进行PCV2分离，获得PCV2-FJ11株，并对其Rep蛋白编码区部分序列进行测定，为丰富福建地区PCV2的基因特征和PCV2流行特征奠定基础[5]。

4参考文献

[1] ALLAN G M，ELLIS J A.Porcine circoviruses：a review[J].J Vet Diagn Invest，2000，12（1）：3-14.

[2] ALLAN G，MCNEILLY F，KENEDY S，et al.Isolation of porcine circovirus-like viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest，1998，10（1）：3-10.

[3] TISCHER I，PETERS D，RASCH R，et al.Replication of porcine circovirus：induction by glucosamine and cell cycle dependence[J].Arch Virol，1987，96（1-2）：39-57.

[4] 陈庆新，周继勇，叶菊秀，等.猪Ⅱ型圆环病毒浙江株的分离及全基因组结构分析[J].微生物学报，2004，44（4）：526-529.

[5] 陈洁，金尔光，郭一，等．猪圆环病毒感染相关疾病及防控措施[J].现代农业科技，2010（21）：363-364．