MicroRNA—29a 在脂多糖诱导人单核细胞凋亡中的作用和机制

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【摘要】目的 探讨microrna-29a（miR-29a）对人单核细胞株THP-1凋亡的作用及其机制。方法 体外培养人单核细胞株THP-1和人胚肾细胞株293T，合成人miR-29a的拟似物（mimic）和抑制剂（inhibitor）。用脂质体Lipofectamine RNAiMAX转染miR-29a的mimic或inhibitor进入THP-1细胞，分组处理后收集细胞标本。第1组细胞转染mimic （100 nmol/L） 48 h；第2组细胞先转染 inhibitor （100 nmol/L） 24 h，再用脂多糖（LPS） 诱导24 h，分别用流式细胞仪方法检测两组细胞凋亡，用real time RT-PCR 方法检测抗凋亡基因 Bcl-2和Mcl-1 的表达变化。构建Bcl-2 和Mcl-1 的荧光素酶报告基因载体，用脂质体 Lipofectamine 2000 转染293T 细胞（DNA 质粒和miRNA 片段共转染），双荧光素酶报告基因系统（luciferase）检测荧光素酶的表达变化。应用SPSS 13.0统计软件，采取单因素方差分析或t检验进行数据统计分析。结果 THP-1细胞转染miR-29a 的mimic 48 h后，细胞凋亡较对照组增加（17.38%增加至42.06%）；单独用LPS 诱导THP-1 细胞，24 h 后细胞凋亡较对照组增加；THP-1 细胞先转染inhibitor 24 h 后，再用LPS诱导24 h，细胞凋亡较单独用LPS诱导组减少（由51.50%降至38.09%）；THP-1细胞转染miR-29a的mimic后，抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的表达水平降低明显（P

【关键词】微小RNA；单核细胞；脂多糖；凋亡；Bcl-2基因；Mcl-1基因

MicroRNA-29a regulates apoptosis induced by lipopolysaccharide in THP-1 cells XIONG Xu-ming， ZHANG Zhen-hui， JIANG Zi-xin， CHEN Wei-yan， YANG Qi-lin， LIU Wei-jiang. Intensive Care Unit， The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College， Guangzhou 510260， China

【Abstract】Objective To investigate the effects of microRNA-29a （miR-29a） on lipopolysaccharide （LPS）-induced apoptosis in human monocytes THP-1 cells in order to understand the molecular mechanisms. Methods Human monocytes THP-1 cell line were exposed to LPS after transfected with miR-29a inhibitors （100 nmol/L） or just transfected with miR-29a mimic （100 nmol/L） by lipofectamine RNAiMAX. Flow cytometry （FCM） was used to detect the cell apoptosis. Real-time RT-PCR was employed to measure expressive levels of the gene Bcl-2 and Mcl-1. The luciferase assay was performed in HEK293T cells， which were co-transfected with plasmid DNA and miRNA by using Lipofectamine 2000. Statistical analysis carried out by using SPSS 13.0 software for One-way ANOVA and Student’s t test. Results Transfection with miR-29a mimics for 48 h increased apoptosis rate and significantly reduced the expressions of Bcl-2 and Mcl-1 in THP-1 cells in comparsion with the control group. The apoptosis rate also raised in THP-1 cell stimulated by LPS for 24 h followed by LPS stimulation for 24 h， the apoptosis rate was decreased in comparison with the LPS group. In addition， our luciferase assay data showed that HEK293T cells co-transfected with miR-29a mimics and Bcl-2 3’UTR-Wt or Mcl-1 3’UTR-Wt plasmid significantly reduced the luciferase activity compared with the control group. Conclusions The miR-29a may regulate apoptosis by targeting the genes Bcl-2 and Mcl-1， and miR-29a may play a pivotal role in the process of apoptosis in immune cells.

【Key words】MicroRNA；Monocytes；Lipopolysaccharides；Apoptosis；Bcl-2；Mcl-1

脓毒症（sepsis）具有患病率高、病死率高、治疗费用高等特点［1-3］，是目前重症医学领域最受关注的临床难题之一。而脓毒症的发病机制仍欠清晰，免疫功能紊乱尤其是免疫功能抑制被认为是脓毒症发病的重要环节，其中免疫细胞凋亡与免疫功能抑制密切相关，抑制免疫细胞凋亡能有助于改善机体免疫功能，进而提高生存率［4］。范震等［5］的研究结果显示microRNAs（miRNAs） 参与脓毒症的发病过程。有研究结果表明，microRNA-29a （miR-29a）参与肿瘤细胞凋亡的调控，而关于miR-29a对免疫细胞状态的影响及其机制的研究，目前仍缺乏报道。本研究采用内毒素脂多糖（LPS）诱导人单核细胞株THP-1，模拟脓毒症免疫细胞炎症反应过程，并通过细胞转染的方法，将 miR-29a的拟似物（mimic）或抑制剂（inhibitor）导入细胞内，上调或下调细胞内miR-29a的表达水平，进而观察细胞凋亡水平的变化并探讨其相关分子机制，为阐明miRNAs在脓毒症中的作用及寻找脓毒症干预的新靶向提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人单核细胞系（THP-1）细胞株和人胚肾细胞株293T（购自上海细胞库）。内毒素（LPS）（购自美国Sigma公司）；RPMI-1640培养基、DMEM培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、β-巯基乙醇（购自美国GIBCO公司）；Lipofectamine RNAiMAX、Lipofectamine 2000、Trizol、SYBR Green qPCR 试剂盒均购自Invitrogen公司； Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒（购自南京凯基生物公司）；报告基因活性检测试剂盒（Dual-Luciferase? Reporter Assay System， Promega）；pGL3-control-MCS和Renilla luciferase质粒（Invitrogen公司），内切酶和连接酶（美国Fermentas公司），质粒提取试剂盒（美国Omega）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及传代方法 将THP-1细胞置于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，于37 ℃、5％ CO2培养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，细胞含量控制在1×106/ml，每2 d换液一次，每4 d传代一次。细胞复苏后，传至3～5代后用于实验。细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，待细胞贴壁融合率达到80%时进行转染。

1.2.2 实验分组 将按1.2.1项操作所得THP-1细胞分为正常对照组（CON组）、LPS组（加入LPS 1 μg/ml诱导细胞，相应CON组用PBS代替LPS，诱导24 h后收集细胞检测）、miR-29a拟似物转染组（简称miR-29a mimic组，转染48 h后收集细胞检测），miR-29a拟似物转染对照组（negative control组，简称NC组，转染48 h后收集细胞检测），miR-29a抑制剂转染组（简称miR-29a inhibitor组，转染48 h后收集细胞检测）。

1.2.3 寡核苷酸序列设计与合成 miR-29a的拟似物（mimic）根据其成熟体序列（miRBase accession No.MI0000087）合成。miR-29a的抑制剂则采用 miR-29a成熟体的反向互补序列，并对所有碱基都进行 2’-甲氧修饰（由吉玛公司设计）。双链 RNA 的负对照（NC）为与哺乳动物基因组没有同源性的序列，该序列的设计和所有核苷酸的合成均由上海吉玛公司完成。所有PCR引物均由上海英骏生物公司合成（表1）。

1.2.4 载体构建 Bcl-2 和 Mcl-1 3’UTR 报告基因载体 pGL3-BCL2-3’UTR-Wt 和pGL3-MCL1-3’UTR-Wt 携带野生型（wild type， Wt）的 3’UTR，而 pGL3-BCL2-3’UTR-Mut 和pGL3-MCL1-3’UTR-Mut 则携带突变了 miR-29 识别元件的 3’UTR（突变体，Mutation， Mut）。所有载体均以 pGL3-control-MCS为基础，在 ApaI 和 XbaI 的酶切位点间插入野生型或突变型的 Bcl-2 和 Mcl-1 3’UTR 序列获得的。野生型插入片段的模板是 BCL2 基因（NM_000633）和 MCL1 基因（NM_021960）的 3’UTR。突变型插入片段的模板是以野生型载体为基础，在 PCR 扩增使用的引物上引入突变位点，在分别扩增突变位点上下游两段序列后，通过融合 PCR及酶切产生［6］。

1.2.5 细胞转染和报告基因活性检测 miRNA的单独转染采用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX。以6孔板为例，THP-1细胞更换新鲜的RPMI 1640培养基（不含FBS和抗生素）每孔2 ml。将miRNA稀释于200 μl Opti-MEM培养基中；每管加入8 μl Lipofectamine RNAi MAX，轻柔混匀，室温放置15 min；将 RNAi MAX与siRNA的稀释液加入 6孔板的各孔细胞中，混匀后培养箱中培养48 h，48 h后按实验需要处理细胞。miRNA的终浓度为100 nmol/L。转染后24 h加LPS，加LPS后24 h收集样本。

在双荧光素酶报告系统（luciferase）实验中转染 293T 细胞：首先在转染前一天，细胞先传代铺于48 孔板培养（用不含FBS和抗生素的DMEM培养基），铺板后24 h，用Lipofectamine 2000 进行转染，将小分子 RNA 和表达质粒稀释于25 μl opti-MEM 中，轻柔混匀；将1 μl Lipofectamine 2000稀释于25 μl opti-MEM 中，混匀，室温放置 5 min；将上两液混合，室温放置 20 min；然后加入 48孔板各孔的细胞中， RNA的浓度为 10 nmol/L， firefly luciferase质粒10 ng，Renilla luciferase 质粒 2 ng，混匀后培养箱中培养6 h，更换培养基（含10%FBS的DMEM）再培养42 h后收集细胞，按照报告基因活性检测试剂盒按说明书，用化学发光法检测酶活性。

1.2.6 RNA提取及real time RT-PCR 细胞总 RNA 提取按 Trizol 试剂盒说明书操作；使用invitrogen的逆转录反应试剂盒，按试剂盒说明书进行，反应产物置于-20 ℃保存备用或立即进行PCR扩增；PCR过程按invitrogen的SYBR Green qPCR 试剂盒说明书在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行，使用18S作为内参照同时进行PCR，获得Ct值后，应用比较Ct法进行相对定量，目标基因的相对定量用2-Ct计算。

1.2.7 细胞凋亡水平检测（Annexin V-FITC 染色法） 收集细胞时直接将悬浮生长的THP-1细胞轻轻吹打混匀，收集细胞悬液，500 r/min 4 ℃离心10 min，弃上清液。将细胞悬于标记缓冲液中。然后，加入 Annexin V-FITC，避光室温反应 15 min。加入标记缓冲液，用流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行数据的分析处理，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间差异只有两组时用成组t检验，有多组时用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。以P

2 结果

2.1 过表达miR-29a促进THP-1细胞凋亡

THP-1细胞转染miR-29a mimic 100 nmol/L后，经流式细胞仪检测，与NC组比较，细胞存活率由82.62%下降至57.94%，提示THP-1细胞过表达miR-29a可导致细胞凋亡水平增加（图1）。

2.2 下调miR-29a的表达水平能抑制LPS诱导的THP-1细胞凋亡

THP-1细胞先转染miR-29a 的抑制剂100 nmol/L，24 h后再用LPS（1 μg/ml）诱导，与单纯用LPS（1 μg/ml）诱导比较，抑制剂组细胞的存活率增高（由48.50%提高至61.91%），提示下调THP-1细胞miR-29a的表达水平可抑制LPS诱导的细胞凋亡（图2）。

2.3 过表达miR-29a后 Bcl-2 和Mcl-1的表达下降

THP-1细胞转染miR-29a 100 nmol/L 48 h后，用real time RT-PCR检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA的表达水平，结果提示，与CON组和NC组比较，Bcl-2 和Mcl-1的mRNA表达水平均下降，降至（0.55±0.12）和（0.65±0.06），P

2.4 双荧光素酶报告基因系统验证miR-29a的靶基因

293T细胞同时转染miR-29a的mimics和Bcl-2 （或Mcl-1）的报告基因载体（Wt野生型和Mut突变体），结果显示，与对照组比较，转染Bcl-2或Mcl-1野生型（Wt）载体的细胞荧光素酶活性下降，分别由（1.07±0.18）和（1.00±0.03）降至（0.63±0.12）和（0.58±0.10），P0.05）。结果提示miR-29a能特异性地与Bcl-2和Mcl-1基因的3’UTR的种子序列结合，降解Bcl-2和Mcl-1的mRNA（图4）。

3 讨论

脓毒症的发病机制异常复杂，涉及感染、炎症、免疫、凝血、细胞凋亡以及神经-内分泌异常等一系列问题，并与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关［7］。免疫功能紊乱尤其是免疫功能抑制被认为是脓毒症发病的重要环节，其中免疫细胞凋亡是脓毒症免疫抑制状态发生的一个重要机制，直接影响脓毒症患者的转归和预后［8］，可能为临床干预提供新的靶点和契机。Hotchkiss等［9］发现，通过脓毒症鼠过度表达Bcl-2基因，几乎可以完全阻止脓毒症所诱导的淋巴细胞凋亡。由此预测，调控Bcl-2相关的细胞凋亡过程，有可能改变脓毒症的免疫功能状态。

miRNAs是一类长度约22个核苷酸大小的内源性非编码RNA，它可通过识别靶基因mRNA的3’端非编码区（3’UTR），并与之结合阻止翻译或导致mRNA降解，从而抑制靶基因的表达［10-12］。Taganov等［13］用LPS刺激人单核细胞，miRNA芯片检测发现miR-146a、miR-155和miR-132的表达量增高，并证实LPS是通过TLR4的信号通路调控miRNAs的表达变化，其中miR-146a是以IRAK-1（IL-1受体相关激酶1）和TRAF6（TNF受体相关因子6为靶点，通过调节NF-κB来实现对TLR4/IL-4信号途径的负调控；曾振国等［14］研究应用LPS刺激NR8383肺泡巨噬细胞，miR-146a的表达上调，且随着刺激时间的延长，miR-146a的表达有增高的趋势。Pauley等［15］则通过转染miR-146a拟似物进入THP-1细胞，证实可以下调由LPS诱导的细胞因子表达，但关于miRNA对脓毒症的发病过程的报道目前仍较缺乏。

Xiong等［6］的研究结果表明，miR-29参与肿瘤细胞的凋亡调控，在肝癌细胞中miR-29的表达水平降低，在肝癌细胞中过表达miR-29能促进肝癌细胞的凋亡，但miR-29能否调控免疫细胞凋亡，目前国内外未见报道。本实验先用LPS 诱导THP-1 细胞，能使细胞的凋亡水平增高，证实LPS能诱导THP-1 细胞凋亡。再通过细胞转染的方法，将合成的miR-29a的拟似物导入THP-1细胞中，达到过表达miR-29a的目的，结果显示THP-1的细胞凋亡水平增高，这与LPS诱导THP-1 细胞凋亡的效应类似；接着，THP-1 细胞先转染miR-29a 的inhibitor，阻断细胞内miR-29a的作用，再用LPS诱导细胞，结果细胞凋亡水平较单纯用LPS刺激降低，提示阻遏miR-29a的作用，能抑制LPS诱导的细胞凋亡。本研究应用生物信息学软件Targetscan，寻找miR-29a直接作用的靶点，发现抗凋亡基因Bcl-2 和Mcl-1的mRNA序列中，它们的3’UTR非编码区有能与miR-29a结合的种子序列，因此，在THP-1中过表达miR-29a后，用real time RT-PCR方法检测Bcl-2 和Mcl-1 mRNA表达水平，结果发现它们的表达水平下降，提示过表达miR-29a能抑制Bcl-2 和Mcl-1表达；Luciferase 实验证实，miR-29a可特异性抑制带有 Bcl-2 和Mcl-1 3’UTR上野生型识别元件的报告基因表达（P

综上所述，miRNA参与脓毒症细胞免疫功能调节过程，本研究结果显示miR-29a能通过靶向于两个抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1调控THP-1细胞凋亡水平，提示miR-29a在调控免疫细胞的凋亡过程中具有重要的作用，借助miR-29a进行免疫细胞凋亡水平调控，有望能改善脓毒症免疫细胞功能状态。

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（收稿日期：2012-08-12）

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2013.01.009

基金项目：广东省自然科学基金（10151018201000018）；广州市医药卫生科技项目（201102A213020）

作者单位：510260 广州，广州医学院第二附属医院重症医学科

P40-P45