醋制降低京大戟对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC―6毒性研究

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[摘要] 目的：比较京大戟醋制前后对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6的毒性差异，初步探讨京大戟醋制减毒机制。方法： 以大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6为研究对象，采用MTT法检测京大戟醋制前后对IEC-6细胞活性的影响，采用倒置显微镜观察醋制前后对细胞形态的影响；采用高内涵细胞成像系统（HCS）分析醋制降低肠细胞线粒体凋亡通路。结果： 与阴性对照组比较，增殖抑制实验显示京大戟生品具有较强的肠细胞毒性（P

[关键词]京大戟；醋制；大鼠小肠隐窝上皮细胞（iec-6）； 高内涵细胞成像系统（HCS）

京大戟为大戟科植物大戟Euphorbia pekinensis Rupr.的干燥根，用于治疗水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆喘咳，二便不利，痈肿疮毒等[1]。但京大戟对口腔黏膜、咽喉部以及胃肠黏膜有严重的刺激性，可引起呼吸衰竭[2]，以及细胞毒作用[3-4]，不仅严重制约着临床的用药安全，也为新药创制带来了困难。中医传统采用醋制来降低京大戟的毒性，缓和其泻下作用[5]，但对于醋制降低京大戟毒性作用的物质基础及作用机制，国内外迄今尚未见明确报道。前期本课题组已完成京大戟细胞毒性部位的筛选，确定京大戟的细胞毒性部位为石油醚部位和乙酸乙酯部位，其中石油醚部位的毒性更强[6]。因此，本研究以体外培养的大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6为研究对象，拟从石油醚部位对大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6细胞活性等方面探讨醋制降低京大戟胃肠道毒性的作用机制，以期为京大戟醋制减毒的物质基础与作用机制提供参考。

1 材料

1.1 药材 京大戟饮片购于安徽亳州药材市场，经南京中医药大学乐巍副教授鉴定为大戟科植物京大戟E. pekinensis的块根。

1.2 供试品溶液的制备 京大戟生品（JDJ-1）：取京大戟饮片100 g，粉碎，打粉备用（过2号筛）；京大戟醋品（JDJ-2）：按照《中国药典》2010年版，取净京大戟100 g加食醋30 g，加水稀释至200 mL（浸没药材），焖润2 h，文火煮沸至醋吸净，切开无白心，取出，凉至六、七成干，减压干燥（40 ℃）8 h，粉碎，打粉备用（过2号筛）。

称取上述粗粉各50 g以10倍量乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，50 ℃减压回收溶剂至近干，继用石油醚萃取至无色，合并萃取液，50 ℃减压回收溶剂至近干，得京大戟生品和醋品浸膏（得率分别为4.3%，4.1%）。精密称取上述浸膏，用DMSO溶解，再用无血清的培养液稀释（DMSO终浓度小于0.5%），使各样品均有50，100，200，400，800 mg・L-15个质量浓度。配好的各组以0.22 μm滤器推滤除菌，即得。

1.3 细胞株与试剂 大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6（购自ATCC）。DMEM（Gibco，批号12100-038）；胎牛血清（Wisent，货号085-150）；胰蛋白酶（Bio-sharp，批号27250-018）；磷酸缓冲盐（PBS）（博士微生物工程有限公司，批号AR0030）；MTT（solarbio，批号M8180）；DMSO（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

1.4 仪器 AY220电子分析天平（日本岛津，精度为万分之一）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；电热恒温水浴箱（上海精宏实验设备有限公司）；JEM-1200EX透射电子显微镜（日本JEOL公司）；VIT 700高内涵细胞成像分析系统（美国ThermoFisher Scientific公司）；微量高速离心机（美国LabNet公司）；Powerwave X340全波长酶标仪（美国Bio-Tek公司）；CO2恒温培养箱（美国NAPCO公司）；KQ-500B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；MDF-382ECM超低温冰箱（日本SANYO）；TGL-16M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；WH-90A微型漩涡混悬器（上海振荣科学仪器有限公司）；脱色摇床（南京大学普阳科学仪器研究所）。

2 方法

2.1 细胞常规培养 ICE-6细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃，5%CO2及饱和湿度条件下细胞培养箱中培养。用含0.03%EDTA-0.25%胰蛋白酶液消化，传代，取状态良好，增殖旺盛的细胞用于本试验。

2.2 MTT法测定细胞相对抑制率 取对数生长期ICE-6细胞，含0.03%EDTA-0.25%胰酶消化，调整细胞密度为1×104 个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中（96孔板周围一圈加不含血清的DMEM培养液），置37 ℃，5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。孵育24 h后，加入每孔100 μL不同浓度的京大戟生品和醋品各供试品溶液，使终质量浓度分别为50，100，200，400，800 mg・L-1，实验同时设无细胞对照组和阴性对照组（control组），无细胞对照组以排除假阳性，阴性对照组加入等体积含0.4%DMSO的无血清培养液。每组设5个复孔，培养48 h后，每孔加入新鲜配制的5 g・L-1的MTT 溶液20 μL，继续培养4 h，轻轻吸弃上清，每孔加DMSO 150 μL，水平摇床混匀，酶标仪于490 nm波长处测定吸光度A。计算京大戟醋制前后对肠细胞ICE-6生长的抑制率（IR）=（1-A给药组均值/A阴性对照组均值）×100%。