DMBA诱导大鼠乳腺癌癌前病变的组织病理学研究
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摘 要：目的：研究二甲基苯蒽(dmba)诱导不同品系大鼠乳腺的病理改变，探讨造模的成模规律及成功率，建立可靠的乳腺癌癌前病变动物模型。方法：随机抽取42只SD大鼠和10只wister大鼠，分为4组：空白对照组(12只)、SD模型Ⅰ组(15只)、SD模型Ⅱ组(15只)和Wister模型组(10只)，采用DMBA10mg/100g一次性灌胃造模，动态观察大鼠大体形态及组织病理学改变。结果：SD模型Ⅱ组大鼠在第9周出现肉眼可见肿瘤，wister大鼠未发现；空白对照组全部为正常乳腺，SD模型Ⅰ组、SD模型Ⅱ组、Wister模型组的乳腺癌癌前病变发生率分别为25%、40%、22.2%，SD模型Ⅱ组高于其他两组(P
关键词：乳腺癌癌前病变；动物模型；组织病理学；实验研究
中图分类号：R285.5
文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)03-0505-04
A Pathological Study of Rats’ Mammary Precancer Models Medicine- induced by DMBA
LI Jing-wei1，SONG Ai-li1，ZHANG Jing-tao2， LIU Xiao-fei1，YIN Yu-kun1
(1.Hospital Affilicated to Shandong University of Chinese Medicine，Jinan 250011，Shandong，China；
2.Master of 2005 Grade Class，Shandong University of Chinese Medicine，Jinan 250011，Shandong，China)
Abstract：Objective：Explore the facture of medicine-induced animal model of rat mammary cancer precancerous lesion. Methods：52 rats were assigned to 4 groups at random：the control group were feed conventionally for 14 weeks， the SD -Ⅰ group induced SD rats with 7，12-dimethylbenz anthracene (DMBA) for 10 weeks，the SD-Ⅱ group induced SD rats with DMBA for 14 weeks， and the Wister model group induced Wister rats with DMBA for 14 weeks. After the experiment， the breast tissue was cut off and observed in Pathological Changes. Results：All rats of the control group were normal. The incidence rate of mammary precancer of the three groups were 25%，40%，22.2%， and the SD-Ⅱ group was more than other two groups (P
Keywords：mammary cancer；precancerous lesion；animal model；experiment study
近年来在乳腺癌领域的研究日渐深入，逐步认识到癌前病变是癌变过程必经的阶段，也是可逆转的阶段[1]，对乳腺癌的二级预防具有重要意义。采用二甲基苯蒽(7，12- demethylbenz[a] anthrancene，DMBA)诱导大鼠乳腺癌是较为成熟的实验方法[2-3]，对乳腺的选择作用强，特异性高，但是在癌前病变动物造模方面研究尚少，散见于乳腺癌的造模研究报道中，而且在DMBA的应用剂量、成模时间点、实验动物品系选择等方面，文献报道尚不一致[4-5]。本研究选用SD和Wister两种常用品系大鼠，在不同时间点对照观察大鼠大体形态表现及组织病理学改变，探讨造模的成模规律及成功率，为深入研究乳腺癌癌前病变的病因和发病机理，从而对其进行有效预防、提高疗效提供实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康未育Wister雌性大鼠10只，鼠龄为出生后6周，体重255～310g，健康未育SD系雌性大鼠42只，鼠龄为出生后6周，体重190～235g，由中国科学院上海实验动物中心提供，质量许可证号SCXK(沪)2003-0003。常规饲养方法1周，适应环境后开始实验。
1.2 实验试剂 二甲基苯蒽(Sigma公司生产，产品编号D3254-5G，087K1196)，5g/支，溶于500mL芝麻油备用；乙醇、二甲苯、苏木素、伊红等。
1.3 实验仪器 OLYMPUS(BH-2)照像显微镜、光学显微镜、Leize切片机、精密游标卡尺等。
1.4 动物分组及造模方法 42只SD大鼠随机分为3组，10只Wister大鼠一组。①空白对照组：SD大鼠12只，一次性胃管灌注生理盐水1mL/100g，常规饲养14周。②SD模型Ⅰ组：SD大鼠15只，一次性胃管灌注DMBA 100mg/kg，常规饲养10周。③SD模型Ⅱ组：SD大鼠15只，一次性胃管灌注DMBA 100mg/kg，常规饲养14周。④Wister模型组：Wister大鼠10只，一次性胃管灌注DMBA 100mg/kg，常规饲养14周。
1.5 观察项目及方法 ①造模后每日观察大鼠一般生理情况，每周称重一次。②实验前一天用脱毛剂将大鼠胸部鼠毛去除，实验当天1%戊巴比妥钠按40mg/kg经腹腔注射麻醉后，观察记录外观、发育情况及或其他部位肿瘤情况。③用精密游标卡尺测量第5对直径。④无菌条件下取大鼠胸腹部第4、5、6对乳腺及其周围皮肤、皮下组织约1.0cm×1.0cm，共6只。自部对半切开乳腺大体观察、计数肿块数量、形态及大小。⑤标本中尔马林固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色进行组织学观察。
1.6 病理诊断标准 乳腺病理诊断标准参考《WHO肿瘤分类》[6] 。
(1)导管上皮一般增生(UDH) ：不规则的窗孔，边缘窗孔，伸展或扭曲的细胞桥，流水状的细胞排列，核不均匀分布、相互重叠等。细胞学图像：上皮细胞表现多样，细胞边界不清，核表现多样等。
(2)乳腺非典型增生(ADH)：导管高度扩张，上皮层次增多，细胞为单一型或两型(存在少数肌上皮细胞)，导管腔隙可为增生的细胞所充塞，细胞间有推挤及重叠现象，细胞大小形态可不同，染色质增加，偶尔可见核分裂象。特别强调细胞排列极性在诊断中占有极重要的地位，当不典型增生时仍保持着部分或某种程度的极性排列。
(3)导管内癌(DCIS)：上皮增生明显，轻度至重度的细胞异型。按结构类型分为几个亚型：微型、型、实体型、筛状型和粉刺型。
1.7 统计方法 计数资料采用Ridit分析；体重资料为单因素方差分析和均数的两两比较方法；直径采用重复测量资料的方差分析，采用SPSS13.0软件进行分析。
2 结 果
2.1 大鼠一般情况变化 见表1。
大鼠胃管灌注二甲基苯蒽后第2周，各组均出现死亡情况，第6周逐渐平稳。试验结束时各组剩余动物数量分别为：空白对照组12只、SD模型Ⅰ组12只、SD模型Ⅱ组10只、Wister模型组9只。Wister模型组死亡大鼠比例较SD模型Ⅰ组和SD模型Ⅱ组少(P
2.2 大鼠体重变化 见图1。
统计结果表明，大鼠胃管灌注二甲基苯蒽后，SD模型Ⅰ组和SD模型Ⅱ组较空白对照组第2～6周体重增长速度减慢，第6～10周呈平行上升，第10周后体重逐渐趋于一致，组间比较有明显差异(P
2.3 大鼠肉眼可见肿瘤出现情况 见表2。
结果表明，空白对照组和Wister模型组大鼠未发现肿瘤，SD模型Ⅰ组和SD模型Ⅱ组大鼠均出现肉眼可见肿瘤，SD模型Ⅱ组较SD模型Ⅰ组肿瘤发生率高，数目多，之间有差异(P
2.4 大鼠直径情况 见表3。
大鼠直径统计结果表明：所有DMBA造模组大鼠第五对直径均高于空白对照组大鼠(P
2.5 大鼠乳腺病理学改变 见表4。
大鼠乳腺组织病理学观察结果显示，空白对照组全部为正常腺体；SD模型Ⅰ组、SD模型Ⅱ组、Wister模型组的正常乳腺乳腺发生率分别为25%、10%、77.8%，SD模型Ⅱ组高于其他两组(P
3 讨 论
3.1 DMBA诱导大鼠生长情况 本实验采用DMBA一次性灌胃制造大鼠乳腺癌癌前病变动物模型，用药1周后大鼠均出现饮食量减少，反应迟钝，行动迟缓，眼睛眯小，有眼眵，毛色枯黄脱落，粪便稀、小、少，尾呈棕黄色且有鳞片出现，身体瘦小，舌质紫黯、瘀斑等。体重检查结果显示，大鼠在DMBA灌胃后增长速度较空白对照组减慢，至第6～10周才呈平行上升，第10周后体重趋于一致，提示DMBA可影响大鼠全身情况，导致生命质量下降。
造模大鼠第2～6周出现死亡情况，而空白组全部正常，排除自然死亡原因，结合姜军等[7]实验中同样出现死亡现象，主要考虑为DMBA的药理毒性引起，提示在选择DMBA的用药剂量、给药次数时还应慎重。
3.2 DMBA诱导大鼠大体形态变化 实验开始时，大鼠较小，不容易触及。7周后，逐渐触及突出的小。在第9周，SD模型Ⅱ组大鼠首次发现乳腺部位小结节，直径0.3～0.5cm大小，呈圆形，边界清楚，质地韧硬，可活动，肿瘤逐渐增大。至第14周，共有5只SD大鼠7处肿瘤，其中wister大鼠未发现肿瘤，SD模型Ⅱ组1只大鼠出现、腹股沟3处肿瘤。肿瘤最大为4cm×5cm×5cm，肿瘤呈实性或囊性，与皮肤粘连，可见皮肤溃破或身体外形明显改变，与相关报道基本一致[8-9]。结果提示DMBA可诱导大鼠形态发生明显变化。见图2～5。
3.3 DMBA诱导大鼠组织病理学特点 空白对照组大鼠组织病理观察结果全部为正常乳腺组织，SD模型Ⅰ组、SD模型Ⅱ组、Wister模型组的正常乳腺乳腺发生率分别为25%、10%、77.8%，组间比较有显著差异，说明DMBA可诱发SD大鼠和wister大鼠乳腺异常改变。组织病理学表现为：导管上皮细胞腺型增生多为导管终末芽体和终末导管实团；部分出现非典型增生、原位癌，导管高度扩张，上皮层次增多，细胞间推挤或重叠，细胞大小形态不同，染色质增加，偶尔可见核分裂象；诱发的肿瘤多为腺癌，细胞排列紊乱，失去正常的结构和层次，胞核增大，核分裂增多，与高玉彤等报道一致[10]。有学者认为，在DMBA作用下，大鼠乳腺组织的终末芽体不是向腺泡芽体分化，而是呈现导管内增生，形成增生性腺泡小节和增生性终末芽体，其中增生性终末芽体与诱发性乳腺肿瘤的发生关系密切，即大鼠诱发性乳腺癌的癌前病变[11]。本实验结果显示DMBA诱导大鼠后，出现一般增生、非典型增生、原位癌及浸润性癌，敏感性和特异性较高。见图6～9。
3.4 DMBA诱导不同时间点大鼠组织病理改变特点 实验结果显示SD模型Ⅰ组较SD模型Ⅱ组的乳腺增生发生率高，癌前病变和浸润性癌发生率低，组间比较有明显差异，说明DMBA诱导大鼠乳腺癌变过程存在时间差[12]，第10～14周是一般增生到癌变的进展期，如果在此期间及时终止实验，获取癌前病变动物模型成功率较高，是成模的最佳时机。
3.5 DMBA诱导不同品系大鼠组织病理学改变特点
Wister模型组无论在动物死亡数、肉眼肿瘤出现率、还是癌前病变和乳腺癌发生率方面，均少于SD模型Ⅱ组，提示其对DMBA造模的敏感性低于SD大鼠。有人认为Wister大鼠乳腺癌发生率低[13]，但相关实验报道未能支持[14]，本实验动物样本量尚少，有待于进一步研究确定。
由上可见，化学致癌剂DMBA一次性灌胃诱导大鼠乳腺癌及癌前病变发生的动态过程是经过乳腺导管上皮细胞“正常一般增生非典型增生原位癌浸润性癌”的逐渐演变过程，与人体组织病理学特点极为相似[15]，造模第10周开始发展为浸润性乳腺癌之前及时截断其发展进程，获取癌前病变动物模型成功率高，特异性强，是癌前病变的干预治疗和乳腺癌的预防提供动物实验研究基础。今后还应加深在DMBA诱导方法的标准化、病理学变化特征及其规律，导管上皮异常增生与癌变关系，以及与人导管上皮异常增生特征比较等方面的研究，使该模型日臻完善。
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