没食子酸与Tau蛋白R3多肽相互作用的研究
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摘要：以阿尔茨海默病相关Tau多肽片段R3作为研究对象，采用ThS荧光法监测R3的自聚集过程，探讨了没食子酸与R3多肽之间的相互作用。实验结果表明没食子酸能够有效抑制R3的自聚集。
中图分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1007-3973(2011)009-071-02
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是最常见的一种老年型痴呆症。据不完全统计，发达国家有50％-70％的早老性痴呆症是AD。阿尔茨海默病有两大病理性特征：神经元内由Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维性缠结(Neurofibril―lary Tangles，NFTs)，神经元外由Aβ沉积形成的老年斑(Se-nile Plaques，SPs)。美国《神经学》杂志报道NFTs与老年痴呆症的临床病情具有高度的正相关性。
NFTs是双螺旋纤丝(Paired helical filament，PHF)的聚合体，PHF的主要成分则是高度磷酸化的微管相关蛋白(Microtubule Associated Protein，MAP)Tau。正常的Tau蛋白通过微管结合区域(Microtubule Binding Domain，MBD)和微管结合，一方面可以促进微管的形成，另一方面可以增加微管的稳定性。在外界因素的影响下Tau蛋白会从微管脱离，同时发生自聚集成双股螺旋丝，进而聚合形成PHFs，此时的Tau蛋白将完全失去其生物学功能。
Tau蛋白有两大结构域：外伸结构域和微管结合域，其中微管结合域决定了Tau蛋白的生物功能，因此通常采用这一片段的多肽进行研究。全长Tau蛋白的微管结合域包含4个重复性单元(Repeat)：R1，R2，r3和R4，每个单元由31或32个氨基酸残基构成。体外实验中发现R2和R3可以表现出和全长Tau蛋白相似的性质，比如它们都可以在诱导剂存在的情况下产生自聚集形成PHFs和NFTs，这也使得R2和R3成为模拟Tau聚集的最佳多肽片段，而R3拥有最小的自聚集浓度和最快的自聚集速度，所以本文采用R3片段来模拟全长Tau蛋白的聚集行为。
3，4，5一三羟基苯甲酸，俗称没食子酸(Gallic acid，GA)，是一种有机酸，常见于五倍子、茶等植物中。因为同时含有酚羟基和羧基，很有可能和Tau蛋白发生氢键作用等分子间作用力，因此本实验研究了没食子酸对R3的抑制作用，希望对阿尔茨海默病的治疗提供一定的实验基础。
在体外实验中，通常采用肝素(Heparin)等多聚阴离子来诱发Tau蛋白的聚集来模拟其自聚集过程。本文也用Heparin引发R3聚集并以ThS作为荧光探针来研究GA对其聚集作用的影响。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：F7000荧光分光光度计，恒温水浴箱，恒温培养箱，高温高压灭菌器。
试剂：没食子酸(AR)，R3(95％)，Tris-HCI缓冲液，ThS荧光探针，Heparin(引发剂)。所有溶液均由高温高压消毒处理后的三重蒸馏水配制而成。
1.2 方法与步骤
(1)所有实验试剂的溶液配制：Tris-HCI缓冲液(50raM，pH=7.5)，R3(1 mg／mL，300pM)，ThS(200pM)，Heparin(76μM)，没食子酸(3mM)。
(2)ThS荧光动力学扫描：向0,5mL离心管中，分别加入：R3多肽(25pL，最终浓度15pM)、ThS(25μL，最终浓度10μM)、没食子酸(x μL)，Heparin(25pL，最终浓度3.8μM)，并用Tris-HCI缓冲液定容至500μL。震荡混匀后，在37℃,嚏温水域环境下进行荧光的Time Scan。参数设置：激发波长为440nm，发射波长为510nm，入射狭缝和发射狭缝宽度皆为10nm，最大扫描时间为7200s。实验结果如图1所示。
(3)ThS荧光法监测GA浓度对R3自聚集的影响：按上述方法配制一系列含不同浓度GA的样品，置于37℃恒温培养箱培养4小时，然后测其在510nm处的发射峰强度。实验参数如下：激发波长为440nm，发射波长范围465-700nm。实验结果如图2所示。
2 实验结果
2.1 ThS荧光动力学分析
在ThS存在的情况下，聚集之后的R3会在510nm处出现发射峰，并且峰强度和R3的聚集程度呈现正相关性。本实验考察了两种不同浓度的GA对R3聚集过程的影响(图1)，发现高浓度的没食子酸能够有效抑制R3的聚集过程。
2.2 ThS荧光法检测GA浓度对R3自聚集的影响
实验中R3的浓度为15pM，GA的浓度分别为0.15μM，30μM,60μM,90μM,120μM,150μM,300μM恒温培养4小时候测得的发射峰如图2所示。
由图2可知，随着GA浓度的增高，R3的聚集程度出现下降趋势，但当GA的浓度在100pM以上时下降趋势变缓。根据上述实验结果可求得GA对R3(15μM)的半数抑制浓度(IC50)约为120pM(图3)。
3 讨论与分析
本文通过荧光动力学证实了没食子酸(GA)能够抑制由Heparin引发的R3多肽的自聚集，紧接着由GA浓度的变化求出其对R3的半数抑制浓度。
研究表明很多黄酮类化合物能够有效抑制Tau蛋白的异常聚集，而没食子酸和黄酮有相似的结构，这也是本实验以GA作为考察对象重要原因。从结构上推测，GA能够抑制R3的自聚集，很有可能归因于其大量的酚羟基和一定量的羧基。因为羧基具有很强的亲水性而且能作为氢键受体和氨基酸肽链或残基形成分子间氢键，酚羟基可以作为氢键给予体和R3的羰基发生氢键作用。此外，GA苯环的疏水作用和ππ堆积作用也可能在抑制R3的聚集中扮演重要角色。最后，Tau蛋白周围环境的活性氧也能够诱发PHFs的形成，而没食子酸据有很强的还原性，有优秀的抗氧化能力，或许能够阻止二硫键的形成，在一定程度上抑制R3形成聚合体。R3聚集的抑制需要较高浓度的GA，可能是因为GA和P,3的分子量相差较大，如果按照1：1结合则GA无法阻止R3的构象变换，只有大量GA附着在R3肽链上才能有效牵制其二级结构的变化，从而抑制PHFs的形成。没食子酸据有抗真菌，抗肿瘤等生物学功效，而且廉价低毒，如果在细胞模型甚至动物模型中都可以抑制Tau蛋白的聚集，那将成为非常实惠的治疗阿尔茨海默病的候选药物。