肝细胞体外三维培养技术进展
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改进肝细胞培养技术，实现大规模体外培养活力旺盛、功能稳定的肝细胞在生物型人工肝支持系统、肝细胞移植等方面具有广泛的用途。近年来，国内外在肝细胞三维组织化培养的研究方面取得了较大的进展，使体外肝细胞培养密度大大增加，肝细胞功能维持时间大大延长。本文就相关文献，对肝细胞体外组织化培养技术的研究进展进行综
述。
1胞外生物支架材料的应用
研究者对各种胞外支架材料进行了研究，包括聚乙烯树脂、海藻酸盐、聚氨酯泡沫等，都是具有亲水多孔性结构的天然或人工合成的有机大分子。在一定的培养条件下，肝细胞在基质孔隙中重组形成许多有功能的聚集体，这些聚集体中可能具有接近的细胞-细胞接触，且形成类似于体内组织的结构，因而表现出比早先单层贴壁培养的肝细胞更好的生理功能。
1.1海藻酸盐(alginate)海藻酸盐是目前常用的促进肝细胞聚集的物质，藻酸盐海绵体具有高度多孔的结构，孔径在100～150 μm，由于藻酸盐是亲水性物质，所以肝细胞能容易地进入基质内部。Glicklis［1］等以藻酸盐海绵体为支持基质培养肝细胞。DNA测定表明最初两周肝细胞的数量并不增加，MTT测定显示绝大多数细胞保持活力。接种24 h内在藻酸盐海绵状结构内观察到活细胞聚集体，这种聚集体在培养的第四天平均直径100 μm，与基质孔径同一数量级。聚集体的三维结构促进了细胞功能的表达：1周内达最大白蛋白分泌量。微囊化肝细胞培养利用半透膜将肝细胞包在囊内(囊壁分子量截率
1.2聚氨酯泡沫(Polyurethane foam，PUF)聚氨酯泡沫是另一种高度多孔性的过滤材料。日本Gion等［3］以PUF为材料设计出一种填充床式生物反应器，以该反应器为基础组成的混合型生物型人工肝（Bioartificial Liver，BAL），在狗肝衰竭模型中，可显著降低血氨和血清肌酐，升高血糖和血压。Pahernik等［4］研究了以PUF材料进行猪肝细胞高密度培养的可行性，作者认为PUF是一种生物相容性较好的材料，适于肝细胞的高密度培养。Kurosawa等［5］采用聚氨酯膜(Polyurethane membrane，PΜM)作为肝细胞培养支持物，构建固定床(fixedbed)生物反应器并用于大鼠肝细胞的高密度培养。PΜM孔径从上层到下层逐渐递减，肝细胞悬液流经PΜM时，5 min内黏附的肝细胞密度可达2～3×107/cm3PΜM，黏附效率高达99%；黏附肝细胞以轻度聚集的球形体形式存在，白蛋白分泌持续时间比单层培养长。
1.3微载体(microcarrier)微载体目前经常用于生物型人工肝的肝细胞培养，可以大大提高生物反应器内肝细胞的培养密度。微载体细胞培养技术可以形成以微载体为核心的肝细胞聚合球，细胞浓度可达107 cell/ml，使肝细胞不贴壁而呈悬浮状培养，更接近于正常的生理状态。Wermer等［6］用不同密度的永生化人肝细胞与不同浓度的明胶微载体进行旋转培养7 d后，2×105 cell/ml与1 g/L微载体组获得的细胞浓度为4.5×106 cell /ml；5×105 cell/ml与3 g/L微载体组细胞浓度为7.1×106 cell/ml。微载体上沾满细胞，呈球形状态。肝细胞24 h可产生5 ng/ml乙基甘油二甲基苯胺(EMGX)，而用50 ng/ml苯巴比妥诱导3 d后，则产生26 ng/ml的MEGX，显示了肝细胞代谢的潜能。目前，微载体培养是动物细胞大规模高密度培养中技术相对完善及有实用价值的一种培养模式，并且已有多种商品化的微载体可供选择。
1.4中空纤维(hollow fiber)中空纤维是人工合成的高分子材料半透膜，纤维内腔直径约200 μm。将数百或数千束纤维装在容器中，即中空纤维舱，最常用于构建生物型人工肝生物反应器。Liu等［7］对体外中空纤维肝辅助装置中的永生化猪肝细胞进行了研究，发现细胞接种后增殖迅速，在培养的25 d期间，肝细胞保持着对安定及扑热息痛的代谢活性。超微结构检查可见形成胆小管结构的桥粒及连接复合体。Sosef［8］等将猪的自体肝细胞置于中空纤维仓，培养24 h后治疗猪急性肝功能衰竭（FHF）模型，明显延长存活时间，降低血氨水平。在多种材料结合的基础上，研究者提出并尝试了多种有应用价值的肝细胞培养系统。Arnaout［9］等在中空纤维外腔植入微载体培养的肝细胞构建生物型人工肝，对FHF和慢性先天性代谢性肝病动物模型均有肝辅助作用。Nyberg［10］等在中空纤维内腔内种植胶原凝胶包埋肝细胞，培养液在胶原外纤维内循环，形成肝细胞培养的三维框架，患者血浆在纤维外灌流，体外实验证明此系统具有合成蛋白功能及药物代谢功能，动物实验能改善FHF动物模型肝功能指标，但未见进一步的临床应用报道。Dixit［11］将两种不同的中空纤维管置于同一外壳内，其中一种通过培养液，纤维外部附肝细胞; 另一纤维管循环宿主血液/血浆。体外实验研究表明这种肝细胞反应器可提供特异性的肝细胞功能。Gerlach［12］等将细胞培养于三维网状交叉的中空纤维之间，实验表明可使肝细胞高密度培养，肝细胞功能维持可达5周。Funatu K［13］等用聚氨酯泡沫(polgurethanefoam，PUF)在离心条件下中空纤维内培养肝细胞，3 d内形成表面光滑的柱型组织化结构(Organoid)，维持肝功能达4个月以上，Nakazawa［14］应用此种生物反应器治疗FHF猪动物模型可改善其生化指标，提高生存率。
1.5其他Tobe S［15］等报道大鼠的肝细胞能够附着着在一种缺乏唾液酸蛋白的聚DP苄乙烯D乳酰氨(polyNpvinylbenzylDlactonamide，PVLA)上形成锚定的多层聚集体，在培养液中加入EGF和胰岛素时形成稳定的三维结构。这种聚集体中的肝细胞有很高的白蛋白分泌能力，作者推测可能是多层聚集体中的细胞通过聚集体的形成而稳定地分化所致。Ohshima等［16］将聚乙烯树脂(Polyvinyl formal，PVF)置于一圆柱形容器内组成一种填充床式生物反应装置，适于肝细胞的培养密度可达107 cell/cm3，且培养肝细胞具有良好的氨代谢、尿素合成及分泌白蛋白等功能；扫描电镜观察显示，肝细胞在形态及排列等方面均优于单层培养。
2模拟微重力培养
模拟微重力肝细胞培养是利用旋转式生物反应器，提供一个模拟微重力的条件，反应器内培养的细胞呈一种失重状态，可自发形成组织样结构。研究者们在一系列的细胞三维培养研究中先后取得重要进展表明，利用回转生物反应器(Rotating Wall Vessel Bioreactor，RWVB)模拟微重力培养环境，可以显著改善离体细胞的生长状况，使在普通培养条件下只能二维贴壁生长的动物细胞表现出三维增殖与分化。Rise k等［17］等利用模拟微重力培养环境共培养纯化的肝细胞与胆管上皮细胞，发现肝细胞与胆管上皮细胞自发聚集于聚合物支架上，生长达2个月，在三维结构上肝组织内有肝索、胆管以及管状内皮结构形成。国内张钰鹏［17］也在模拟微重力条件下进行大鼠原代肝细胞微载体培养，多个微载体表面的肝细胞可连接成团，形成“肝细胞微载体聚球体”的基本结构模式。透射电镜下，肝细胞在不同部位显现不同的膜结构：与培养液接触的表面出现许多不规整的微绒毛，类似体内的肝窦面。肝细胞之间则胞膜平直，膜间缝隙狭窄，类似体内的肝细胞间接触面。
3展望
肝细胞体外培养技术近年发展迅速，模拟微重力应用于肝细胞培养，在医学上有广泛的应用前景。然而因技术方法所限，目前的肝细胞培养仍远不能满足人们的需求。因此，进一步深入研究更加有效的肝细胞体外培养技术，尤其是如何便肝细胞在体外能够保持长时间的活性及功能，这对于研究肝脏疾病的发病机理及其生物型人工肝、肝细胞移植等治疗的临床应用都将有着十分重要的意义。
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