以PXR受体为靶点的中药活性成分筛选及相关药理学研究

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[摘要]孕烷X受体（pxr）作为关键的转录因子调控CYP3A基因的诱导表达，在分子水平上揭示了PXR保护机体免受外源性物质的机制，同时也揭示了一类最主要的药物相互作用模式。PXR除了在药物代谢及药物相互作用中扮演重要角色外，越来越多的研究显示PXR及其调控的靶基因在维持机体内环境稳态，发挥重要生理功能方面扮演重要角色。因此有必要研究中药及天然产物对PXR调节及相关药理作用研究，为挖掘新的药理作用途径提供新的线索，该文就PXR研究进展及本实验室近年来的开展的相关工作进行综述。

[关键词]孕烷X受体;细胞色素P450 3A;石胆酸;溃疡性结肠炎

Pharmacology research on PXR as a potential target in screening

bioactive components of Chinese material medica

WANG Yu-guang1， ZHANG Xian-xie1， LI Han1，3， LU Bei-bei1， ZHOU Jian-ming1， LIU Hao-sheng1，2， HU Dong-hua1，2， ZHOU Tao1，4，

ZHANG Ya-xin1， MA Zeng-chun1， LIANG Qian-de1， TANG Xiang-lin1， XIAO Cheng-rong1， TAN Hong-ling1， GAO Yue1*

（1.Beijing Institute of Radiation Medicine， Beijing 100850， China;

2. Anhui Medical University， Hefei 230032， China;

3. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 330007， China;

4. Guangxi Medical University， Nanning 530000， China）

[Abstract]Pregnane X receptor （PXR） is key transcription factors which mainly regulate the expression of CYP3A genes. At the molecular level， PXR has been revealed the protection mechanism of the body against xenochemicals and a major mode of the drug-drug interactions. Besides playing an important role in drug metabolism and interactions， PXR and its target genes also play an important role in maintaining normal physiological function and homeostasis. Therefore， it is necessary to study the regulation of PXR and its related pharmacological effects of TCM and natural products， and to provide new clues for the new pharmacological pathway.

[Key words]pregnane X receptor; CYP3A; lithocholic acid; ulcerative colitis

doi：10.4268/cjcmm20151721

孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR） 属于核受体超家族（NRs）中的NR1I亚家族，由于该受体能被一系列天然或合成的孕烷所激活，故将其命名为孕烷X受体，其在肝脏、小肠、胃、肾脏等组织中高表达。自该受体发现以来^[1]已相继在小鼠，大鼠，猴及人等哺乳动物克隆出PXR受体。PXR作为内源及外源物激活受体在机体的防御机制中发挥着重要的生物调节作用和“解毒”功能。孕烷X受体（PXR）作为关键的转录因子调控CYP3A基因的诱导表达，在分子水平上揭示了PXR保护机体免受外源性物质的机制，同时也揭示了一类最主要的药物相互作用模式。课题组前期已经对PXR的特性及其在药物代谢中的重要作用发表过相关综述^[2]，PXR除了在药物代谢及药物相互作用中扮演重要角色外，近年来越来越多的研究显示PXR及其调控的靶基因在维持机体内环境稳态，发挥重要生理功能方面扮演重要角色。因此有必要开展中药及天然产物对PXR激活及细胞色素P450酶调节及相关药理作用研究。中医用药特点为合并用药，复方为主，故易产生药物间的相互作用;同时中药成分面临细胞色素P450 酶（cytochromeP450，CYP450）及对其的诱导或抑制，因此中药发生相互作用的机制也必然与药物代谢相关，尤其是与CYP450有关的代谢。因此发展基于CYP450的药物相互作用筛选技术对理解中药配伍毒性的生物学本质和发现中药天然产物新的药理活性是一种有益的思路和方法。现就本课题组近年来在以PXR受体为靶点的中药活性成分筛选及相关药理学研究及其他研究的相关进展进行综述。

1基于PXR-CYP3A 通路的药物相互作用快速筛选技术

PXR作为关键转录因子在CYP3A的诱导表达调控中起核心作用，许多药物对PXR都有潜在的激动活性并最终诱导CYP3A表达。在国家科技重大专项的支持下，作者首次建立了基于PXR-CYP3A4通路的PXR激活快速筛选技术，主要包括新颖的CYP3A4双远端增强子和近端启动子线性串联的分泌型荧光素酶报告基因构建、体外筛选工程细胞株的建立、报告基因技术可靠性验证及在中药化学成分相互作用快速筛选中的运用。通过构建新颖的CYP3A4双远端增强子和近端启动子线性串联的分泌型荧光素酶报告基因并稳定转染HepG2细胞，该工程细胞株实现直接检测细胞上清即能预测化合物的CYP3A4诱导或抑制能力，克服现有pGL系列双荧光素酶报告基因需要裂解细胞、步骤繁琐的不足。在瞬转对比实验中，单远端增强子的分泌型荧光素酶报告基因表现出比单远端增强子的pGL4.17报告基因更优越的RIF诱导响应性能;双远端增强子的分泌型荧光素酶报告基因不仅绝对荧光值要显著高于单远端增强子分泌型荧光素酶报告基因，而且RIF诱导效能进一步提高。利用此体外筛选细胞模型，对本实验室130种中药化学成分单体进行了PXR激活特性筛选实验，获得了具有潜在CYP3A4诱导和抑制能力的目标化合物，为进一步分析中药配伍后毒性成分代谢的变化与中药配伍毒性关系研究，特别是发现以PXR受体为靶点的中药活性成分筛选及相关药理学研究提供了重要线索。

2中药活性成分激活PXR受体及相关药理学研究

PXR受体作为P450酶的重要转录调控子，具有重要的生理病理学意义，在机体适应外界环境、抵抗有毒物质侵袭中起重要作用。PXR可以与外源物结合，形成异源二聚从而激活P450酶，参与不同药物的代谢， 并且可产生药物间相互作用。许多外源性的PXR激活剂为临床治疗用药，如利福平、利托那韦、地塞米松、紫杉醇等，这些药物可通过激活PXR进而诱导CYP3A的表达，从而加速体内其他药物的代谢，潜在的降低了这些药物的药效或产生不利于机体的不良反应。最新研究认为：PXR在参与药物代谢的同时，执行越来越多的重要的生理功能，PXR不但参与药物代谢、药物相互作用，且在多种代谢性疾病、肠炎、心血管疾病、老年痴呆等的治疗方面发挥重要作用，可作为药物筛选与疾病治疗的候选靶点^[3-4]。虽然PXR最初被认定为异源物受体，但事实证明，它也对很多的内源物质产生响应，对生理和病理功能有很大的影响。由于大多数药物通过与靶标分子的相互作用而产生疗效，所以认为PXR可作为一个药物发现及疾病治疗的靶点，为创新药物研究及疾病治疗提供新的视角^[5]。

2.1PXR激活效应的中药天然产物对石胆酸所致胆汁淤积型肝损伤的保护作用

次级胆汁酸石胆酸（LCA）作为二级疏水胆酸，可因体内蓄积而引起动物的胆汁淤积型肝损伤，进而引起血脂及脂溶性维生素的吸收障碍，导致正常经胆汁代谢的有毒物质在体内蓄积，并使过多的胆固醇和胆汁代谢物在体内蓄积而引发毒性^[5]。肝内胆汁淤积是由各种原因导致的肝细胞排泌胆汁障碍，以致肝内胆汁淤滞和血中胆汁成分增多^[6]。由于人类平均每天排放600 mL胆汁，因此很有可能产生胆汁淤积，并由此蓄积而产生毒副作用，因此，应有效消除多余的胆汁酸，以避免毒性作用。

PXR作为一个内源性配体在胆汁的形成、胆血脂的分解、促进其吸收中具有重要生理作用。PXR在解治疗胆汁淤积中发挥了至关重要的作用。不同的动物模型研究表明，PXR的激活可保护多种由LCA引起的肝损伤。PCN预处理的野生型小鼠可减少LCA导致的毒性反应^[7]。此外，PXR高表达的转基因小鼠可对抗LCA引起的肝损伤。CYP3A酶是促进胆汁酸羟基化的重要CYP酶，因此初步推断对抗LCA引起的肝损伤是由于PXR激活了CYP3A酶^[8]。PXR作为靶点具有预防胆汁淤积的功效，PXR和CAR的单缺失或双缺失的小鼠，同样证明PXR可通过调控胆汁酸的转运来防止胆汁淤积。后续研究发现，利福平激活的PXR也可以通过诱导Ⅱ相药物代谢酶SULT2A1基因（胆汁酸羟磺解毒）的表达而加速胆汁酸代谢，且HNF-4α可增强此诱导效应^[9]。

由于激活PXR可防止胆汁淤积，人们建议用PXR的激动剂治疗人类胆汁淤积性肝病。已有临床数据支持这个方法，使用RIF的和SJW治疗胆汁淤积性肝病，RIF减轻淤积淤积以及相关的搔痒与6α-羟基胆汁酸的增加相关，这又促进6α-羟基位置转移酶的葡糖醛酸化。RIF和SJW都是强有力的hPXR激动剂，CYP3A和UGT都是hPXR的靶基因，作者认为 RIF和SJW是通过PXR介导抗胆汁酸作用。因此从天然产物中发现PXR激动剂对于LCA所致的肝损伤具有保护作用。

2.1.1甘草酸和青蒿素对CYP3A mRNA及蛋白的诱导作用甘草入药已有悠久历史，其保肝解毒之功效已得到广泛认可。甘草酸是从甘草根部分离的一种皂苷成分，其抑制肝脏损伤已在多种动物模型中得到验证^[10]，并能促进肝细胞增殖^[11]和肝脏的再生^[12]。亦有研究发现，甘草酸对人和大鼠牛蒡草引发的肝脏毒性具有良好的保护作用^[13]，同时，它能通过抑制IL-18^[14]和基质金属蛋白酶-9^[15]的生成而治疗细菌脂多糖（LPS）诱导的小鼠肝损伤。提示甘草酸是一种潜在的肝保护剂^[16]。

前期筛选结果显示甘草酸对PXR有中等强度的激活作用。进一步研究显示甘草酸对HepG2细胞CYP3A4在转录水平及蛋白水平均产生了明显的诱导作用，并呈时间和剂量依赖效应。瞬时共转染双荧光素酶报告基因和EMSA实验结果显示甘草酸可通过直接激活核受体PXR参与对CYP3A4的转录激活作用，进而使CYP3A4 mRNA及蛋白表达增加。以过量石胆酸造成小鼠肝损伤为模型，这种模型所造成的肝脏损伤主要以肝细胞坏死为主，同时伴有轻度的脂肪变性及炎症反应。在给予甘草和甘草酸后血清中ALT及AST的水平同样得到了显著的下降，同时肝细胞的坏死程度也得到明显改善，提示甘草及其有效成分甘草酸不仅对肝细胞炎症疗效确切，对肝细胞的坏死也具有很好的治疗效果。这不仅说明了甘草具有良好的保肝解毒功能，而且也拓宽了其适应症，为临床更加有效的应用甘草提供了实验依据。组织学的检查显示，与空白组比较，模型组在给予连续4 d注射LCA后肝细胞出现大片坏死灶，肝细胞严重受损，并伴有少量炎性细胞浸润及轻度脂肪变性。而在给予了甘草（10 g・kg-1・d-1），甘草酸（GA，10～50 mg・kg-1），PCN（42 mg・kg-1）后小鼠肝细胞的受损程度明显减轻，其中甘草组中肝细胞可见少量坏死灶及轻度的脂肪变性，而甘草酸组随着剂量的增大，肝细胞的受损程度也得到了显著改善，肝细胞基本接近于正常，无明显坏死症状，偶可见极小的病灶，PCN组肝细胞的受损程度也同样得到了明显改善。

机体中胆汁酸的合成是一个受到及其严格调控的过程，当机体的胆汁酸浓度升高时机体通过2种途径调节胆汁酸的水平以保持其动态的平衡。最初的调节是通过负反馈机制来完成的。胆汁酸作为内源性配体首先激活法尼酯衍生物X受体（farnesoid X receptor，FXR）进而上调PXR基因的表达^[17]，而PXR表达上调后又通过级联反应促使小异源二聚体伙伴分子（SHP）基因的表达上调，随后SHP通过与肝受体同系物-1（LRH-1）发生蛋白-蛋白间相互作用进而阻断CYP7A1基因启动子区的转录活化而抑制其基因的表达，CYP7A1基因编码胆固醇7α-羟化酶，为胆固醇向胆汁酸转化的限速酶，其基因的表达受到抑制必然导致胆汁酸从头合成途径受阻，胆汁酸水平下降。在本实验中，在给予肝损伤小鼠甘草、甘草酸及PCN后，各组中SHP mRNA的表达均明显上升，而CYP7A1 mRNA的表达被抑制，因此推测甘草及甘草酸等外源性配体有可能通过激活PXR受体进而通过负反馈途径减少内源性胆汁酸的合成，尤其是LCA的合成而起到保护肝脏的作用。此外，机体还可以通过第2条途径，即胆汁酸作为内源性配体通过激活PXR受体而诱导CYP3A11（小鼠）、CYP3A4（人），从而使其酶活性升高而加速胆汁酸（LCA）代谢为毒性较低的6α-羟基化合物。本实验中，小鼠在给予甘草，甘草酸及PCN后CYP3A11 mRNA上升，表明甘草及甘草酸可能也通过激活PXR从而在胆汁酸的代谢途径中发挥作用，使得LCA代谢加速而保护肝脏免受损害。综上推测甘草可能通过调控胆汁酸的合成及代谢2条途径，使得胆汁酸的浓度保持相对稳定而达到保肝之目的^[18]。

2.1.2丹参酮ⅡA对石胆酸所致小鼠胆汁淤积型肝损伤的保护作用LCA引起胆汁淤积性肝病模型可以准确模拟人体状态，因此，它是人类胆汁淤积性肝病的常用模型。病理学分析清楚地表明，LCA可引起严重的肝毒性。肝脏切片的HE染色可看出：LCA处理的小鼠表现出大规模的坏死灶，用丹参酮ⅡA（5，10，20 mg・kg-1）或PCN共处理的小鼠肝脏以剂量依赖性方式坏死减弱。

血清生化结果显示，LCA严重损伤的小鼠血清ALT，AST，ALP大量增加，丹参酮ⅡA治疗组剂量依赖性逆转LCA诱导增加的ALT至LCA组的35.15%，30.27%，27.48%，AST至LCA组的45.43%，41.38%，23.2%，ALP为LCA组的57.14%，52.31%，38.5%。LCA组小鼠血清胆固醇、总胆红素、直接胆红素均大幅增高至11 mmol・L-1，335 μmol・L-1和105 μmol・L-1，为空白对照组的3.66，8.77，7.46倍。丹参酮ⅡA 5，10，20 mg・kg-1治疗组剂量依赖性逆转LCA诱导的血清胆固醇至63.64%，53.86%，42.95%，总胆红素至84.1%，47.89%，32.3%，直接胆红素到67.85%，60.52%，38.72%。这些数据清楚地表明，丹参酮ⅡA可以浓度依赖性预防治疗LCA诱导的胆汁淤积型肝损伤。

PXR作为LCA解毒一个受体，推测，丹参酮ⅡA介导的激活PXR并诱导CYP3A可能防止LCA引起的肝毒性肝。定量RT-PCR和免疫印迹分析PXR靶基因的肝脏基因和蛋白质表达，LCA可有增加PXR表达，丹参酮ⅡA可进一步以浓度依赖性方式增强PXR表达。

肝脏药物代谢酶在调节胆汁酸内环境稳定性中发挥重要作用。胆汁酸排毒主要是通过一项代谢酶（Cyp3a11和Cyp3a13）。LCA略有增加Cyp3a11和Cyp3a13的水平。丹参酮ⅡA共同处理持续增强表达。此外，LCA略抑制MDR1α的基因的表达，而丹参酮ⅡA共治疗可急剧增加其表达。且PCN组具有类似丹参酮ⅡA的效果。综合来看，上述数据表明，丹参酮ⅡA对LCA的保肝作用可能是由于PXR及相关基因的上调。

为了进一步探讨丹参酮ⅡA预防治疗LCA引起胆汁淤积的机制，丹参酮ⅡA是否仍然可以在PXR-siRNA介导小鼠肝模型中发挥作用。尾静脉注射PXR-siRNA降低小鼠肝细胞内PXR蛋白表达，注射72 h后显示，与siRNA对照组相比，PXR的siRNA降低PXR表达75%，表明，PXR的siRNA可有效降低PXR的表达。接下来进一步评价丹参酮ⅡA在PXR低表达小鼠中的LCA引起的胆汁淤积型肝病模型的治疗作用。PXR低表达小鼠同时用丹参酮ⅡA或PCN 10 d处理，并于第4天起腹腔注射LCA共7 d，试验期间每72 h重复注射siRNA 1次，连续10 d。结果显示LCA组或阴性siRNA治疗组的小鼠肝脏组织大规模的坏死灶，PXR低表达小鼠肝脏的病理变化略微改善。此外，PXR低表达小鼠给予丹参酮ⅡA 20 mg・kg-1或PCN 45 mg・kg-1，与PXR沉默小鼠相比病变更少。然而，尽管PXR低表达小鼠的胆汁淤积型肝损伤减少，但仍有显著的多灶性肝细胞坏死和胆道增殖，并在肝脏的病理评分有显著差异，治疗效果显著降低。

PXR低表达小鼠血清ALT，AST，和ALP活性略有降低。PXR低表达小鼠给予20 mg・kg-1丹参酮ⅡA可进一步降低ALT，AST，ALP表达至72.66%，67.73%，76.2%，分别与PXR低表达小鼠相比;这些水平保持4.54，3.96，2.33倍，高于空白对照组。LCA组血清胆固醇，总胆红素，直接胆红素均显著升高至8.68 mmol・L-1，335 μmol・L-1和109.2 μmol・L-1，是空白对照组的3.94，5.68，6.24倍。虽然PXR低表达小鼠血清胆固醇升高，总胆红素，直接胆红素水平略有降低，PXR低表达小鼠给予20 mg・kg-1丹参酮ⅡA后，血清胆固醇，总胆红素，直接胆红素降低至LCA组的69.12%，48.1%，76%，这仍然是空白对照组的2.73，2.73，4.76倍。总之， PXR低表达小鼠可轻微防治LCA诱导的胆汁淤积型肝损伤，PXR低表达小鼠给予丹参酮ⅡA或PCN后，仍可预防治疗LCA诱导的胆汁淤积型肝损伤，然而，肝功能损害并没有得到有效改善，这表明PXR低表达小鼠显著降低了丹参酮ⅡA的治疗效果。

体内研究表明，血清生化指标及病理结果分析看出，丹参酮ⅡA可浓度依赖性预防治疗LCA诱导的胆汁淤积型肝损伤。此外，丹参酮ⅡA对LCA引起胆汁淤积的保护作用可能部分通过上调PXR核受体，以及参与LCA代谢的一项代谢酶Cyp3a11，Cyp3a13和MDR1α。结合PXR低表达小鼠实验，PXR-siRNA可有效降低小鼠肝脏PXR的表达，证实了实验有效且具有药理意义。丹参酮ⅡA或PCN可治疗LCA引起的PXR低表达小鼠胆汁淤积型肝损伤，然而，病理损伤依旧存在，胆汁淤积型肝损伤并未得到完全改善，这表明丹参酮ⅡA的治疗作用显著降低，无法发挥有效的保护肝脏作用，因此，丹参酮ⅡA的保肝效应部分基于PXR及其靶基因的活化，然而，丹参酮ⅡA仍具有部分肝脏保护作用，可能是因为PXR没有完全沉默， PXR仍具有一定的生理病学理意义，可参与激活药物代谢酶。

2.2天然产物对PXR受体的诱导及对溃疡性结肠炎的保护作用

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种病因未明的慢性肠道炎症性疾病，分为慢性非特异性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn′s disease，CD），溃疡性结肠炎仅发生于结肠，克罗恩病常见于小肠和/或结肠，但可涉及从口腔到的消化道的任何部分^[19]。是一种慢性的，易反复发作的炎性胃肠道疾病，可严重的影响人们的工作与生活，目前在美国慢性胃肠道疾病发病率中排名前五。IBD的病因不明，目前认为是由多因素相互作用所致，主要包括环境、免疫以及遗传等因素。近日发现PXR基因与人类IBD易感关系密切，在IBD患者中，PXR和PXR的靶基因的表达下降，因此，明确PXR的作用可以为IBD的治疗提供新的方法。PXR作为炎症性肠炎（IBD）的全新靶点已得到了广泛的认可。动物及临床试验结果也表明了PXR对人类肠炎具有潜在的治疗效果。Frank Gonzalez等^[20]研究在认为孕烷X受体很可能成为一种治疗炎症性肠炎的新靶点。基于小鼠PXR配基PCN能显著减轻炎症性肠炎的症状，同时在PXR敲除的小鼠这种治疗作用就消失了，表明PXR受体介导了对炎症性肠炎的治疗作用，进一步的研究显示可能与PXR激活后抑制了NF-κB靶基因的表达有关^[40]。美国FDA在2004年批准了利福昔明（rifaximin）作为治疗炎症性肠炎。RIF激活的PXR抑制了炎症和免疫反应的关键调节因子NF-κB的活性。在PXR基因剔除小鼠中，NF-κB的靶基因的表达在多种组织大幅上调，小肠炎症显着增加，从而证明PXR和药物介导的NF-κB拮抗作用之间的直接联系。其主要的作用机制与PXR依赖方式降低NF-κB信号通路有关。尽管利福昔明在临床试验中证明可以作为炎症性肠炎治疗的有效药物，但其作为抗生素引起的细菌耐药日益受到关注，因为作为炎症性肠炎治疗需要长期用药，因此寻找PXR激动剂并且不具有抗生素的特性的化合物对于炎症性肠炎治疗和减少细菌耐药发生具有重要意义^[21]。而一些天然化合物在这方面具有独特的优势。最近在天然产物中也发现了一些具有炎症性肠炎治疗作用的化合物，如姜黄素（curcumin），solomonsterol A。表明PXR激动剂在治疗与免疫功能缺失导致的炎症性肠炎具有广阔前景。由于丹参酮ⅡA本身属于黄酮类天然产物，同时比较易得，因此将丹参酮ⅡA作为PXR激动剂治疗溃疡性结肠炎的研究有助于发现新的治疗IBD的药物^[22]。

2.2.1丹参酮ⅡA激活PXR受体对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用疗效观察结合本课题组前期构建的PXR受体高通量筛选细胞株和对200余种中药单体筛选，发现了丹参酮ⅡA是活性较强的PXR激动剂，同时预实验显示丹参酮ⅡA对小鼠溃疡性结肠炎明显的治疗作用，因此，进一步考察了丹参酮ⅡA对炎症性肠炎的干预作用及其与PXR通路的相互作用，发现丹参酮ⅡA基于PXR受体靶点治疗炎症性肠炎新的治疗机制，同时对PXR受体与炎症性肠炎疾病之间的关系也可以进行更深入的基础研究，在分子水平上阐明丹参酮ⅡA对炎症性肠炎治疗作用的机制具有重要意义，为中药或天然产物防治炎症性肠炎提供新的线索。

在DSS诱发的溃疡性结肠炎中，丹参酮ⅡA及PXR阳性药PCN组可显著缓解小鼠体重的下降，便血及腹泻情况也较轻。造模7 d后对小鼠进行解剖，发现结肠形态及长度有显著的差异，损伤组的结肠充血、扭曲、缩短，药物治疗组症状明显减轻。病理结果显示：空白组与模型组差异明显，实验各组病理改变轻重程度相比较，以阳性药物组优于高剂量组，优于中剂量组，具有统计学意义。结肠组织的基因分析显示，丹参酮ⅡA对PXR 及其下游基因，如CYP3A11，3A13，MDR1的表达具有诱导作用。

为了进一步验证丹参酮ⅡA预防治疗IBD中，PXR的作用与意义，采用了甲基化修饰的PXR特异性siRNA，以减少siRNA在体内的降解，特异性的与结肠组织PXR目标基因结合，从而减少PXR基因的转录翻译，实验得出，100 mg・L-1的siRNA尾静脉注射至小鼠体内，可将PXR 基因、蛋白水平沉默至40%以下，PXR基因沉默成功，具有实验意义，可进行后期药理学试验。

PXR低表达小鼠给予丹参酮ⅡA治疗后，小鼠体重下降情况并未好转，便血腹泻情况未得到有效治疗，病理变化未好转，与前期未敲低PXR小鼠相比较，临床指标变化具有显著差异。小鼠解剖后发现，给药组结肠虽充血减少，可长度及形态变化明显。基因分析显示，丹参酮ⅡA未能有效的诱导PXR及其下游基因的表达。

炎症介质的基因表达的结果表明，DSS诱导的小鼠IBD结肠组织中TNF，IL-6，iNOS和MCP均显着增高，给予丹参酮ⅡA后炎性介质显著降低，与此相反，PXR低表达小鼠给予丹参酮ⅡA后，炎症介质仍然有较高水平的表达，推测，丹参酮ⅡA预防治疗DSS诱导的IBD与炎症介质激活相关。由此，得出丹参酮ⅡA预防治疗IBD的机制，可能部分由于上调PXR核受体及下游基因，以及下调NF-κB介导的炎性机制。丹参酮ⅡA可浓度依赖性的治疗DSS诱导的小鼠IBD，发挥治疗作用。与野生型小鼠相比，PXR低表达小鼠给予丹参酮ⅡA后，丹参酮ⅡA治疗小鼠IBD的作用降低，研究发现，丹参酮ⅡA预防治疗IBD可能部分通过上调PXR核受体及下游基因，以及下调NF-κB介导的炎性机制而实现，有助于发现PXR靶点在人类IBD治疗中的潜在作用。

2.2.2青蒿素激活PXR受体对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗作用疗效观察青蒿素是我国自主知识产权中药获得国际认可的成功范例。1971年我国科学家在黄花蒿中提取高效低度的抗疟药青蒿素。IBD通常反复发作，迁延不愈，临床表现主要有腹泻、腹痛和黏液脓血便。西方国家IBD的发病率高于亚洲国家，但随着亚洲国家的生活水平的提高，IBD的发病率连年上升。由于IBD病因不明确，所以IBD病理机制的研究和新药的研发一直处于热点。有文献表明，青蒿素可以通过介导PXR，然后激活CYP3A4，而PXR的经典配体利福平（RIF）可以通过激活PXR治疗溃疡性结肠炎。因此采用国际公认的DSS造炎症性肠病模型。然后探讨青蒿素治疗炎症性肠病的分子机制，为进一步研究青蒿素功能提供实验依据和为更进一步考察PXR诱导化合物在炎症性肠病的作用提供依据。

选取了人结肠癌细胞株LS174T，结果显示青蒿素在细胞水平上可浓度和时间依赖性的诱导CYP3A4和PXR mRNA表达。同时对CYP3A4蛋白水平的影响也表现出与转录水平的一致性，表明青蒿素确实对CYP3A4酶存在诱导效应。为了进一步探讨青蒿素对CYP3A4诱导的机制，推测其潜在的机制可能是PXR在受到外源物激活后由胞浆移位至胞核内与CYP3A4转录调控区的一致序列相结合进而组成配体-受体复合物而诱导CYP3A4基因的转录和蛋白的表达。EMSA实验提示PXR与CYP3A4转录调控区的结合为特异性结合，也说明青蒿素对CYP3A4的诱导效应始于PXR与CYP3A4调控区的结合阶段。近年来大量研究显示PXR受体作为关键的转录调控因子在CYP3A基因的表达中扮演着十分重要的角色。因此推测，青蒿素对PXR受体的活化可能代表着其对CYP3A基因诱导表达的机制。为了验证以上推测，采用了报告基因技术来考察青蒿素是否对PXR具有激活作用。结果提示，青蒿素可以促进其转录激活活性进而诱导CYP3A4表达上调，而这一过程由含PXR应答元件（PXR response element）的CYP3A4调控序列介导。

青蒿素可以通过介导PXR，然后激活CYP3A4，而PXR的经典配体利福平（RIF）可以通过激活PXR治疗炎症性肠病，于是采用DSS造溃疡性结肠炎模型，先给予青蒿素预处理3 d，在第4天给予4%DSS。结果表明青蒿素的低剂量、中剂量和高剂量可以减轻炎症性肠病的临床症状。病理切片结果表明青蒿素可以改善溃疡情况，有一定的好转。提示青蒿素对DSS造成的炎症性肠病模型有治疗效果。

同时检测各组小鼠的结肠组织中CYP3a11，CYP3a13，GSTα1和MDR1α和各组小鼠肺、心、肝、肾、胃、脾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠的PXR mRNA 的表达情况。结果表明模型组的CYP3a11，CYP3a13，GSTα1和MDR1α mRNA表达都有不同程度的下调，而低剂量、中剂量和高剂量对CYP3a11，CYP3a13，GSTα1和MDR1α mRNA依次上调，并且有浓度依赖性。PXR mRNA在小鼠的肝、肝、肾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠中都有表达，其中在肝脏和十二指肠表达最高，盲肠和结肠次之。并且模型组的各组织PXR mRNA表达量比其他组的偏低，低剂量、中剂量和阳性药有依次增大的趋势。以前的研究表明激活PXR受体可以抑制NF-κB信号通路。为了进一步研究青蒿素对DSS处理的小鼠炎症性肠病的保护作用，用Real-time PCR检测CCR2，ICAM，IL-1β，IL-6，IL-10，iNOS，MCP-1，TNF-α mRNA的表达，结果提示模型组可以显著诱导CCR2，ICAM，IL-1β，IL-6，IL-10，iNOS，MCP-1和TNF-α mRNA的表达，而低剂量、中剂量和高剂量的诱导作用依次减弱，阳性药PCN可以显著抑制CCR2，ICAM，IL-1β，IL-6，IL-10，iNOS，MCP-1，TNF-α mRNA的表达。这与文献报道一致。因此推测青蒿素作为外源性配体有可能通过激活PXR受体进而通过诱导CYP3a11，CYP3a13，GSTα1和MDR1α，而减轻炎症性肠病症状，同时抑制CCR2， ICAM，IL-1β，IL-6，IL-10，iNOS，MCP-1，TNF-α mRNA的表达，而达到治疗目的。

青蒿素可以通过激活PXR而诱导CYP3A4的表达。在DSS造炎症性肠病模型上，PXR受体是治疗炎症性肠病的关键因子，当一种化合物能诱导PXR的表达就具有潜在的治疗该疾病的能力，而青蒿素可能就是通过激活PXR从而达到治疗炎症性肠病的目的^[23]。

3小结

孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR）作为关键的转录因子调控CYP3A基因的诱导表达，从而在分子水平上揭示了PXR保护机体免受外源性物质的机制，同时也揭示了一类最主要的药物相互作用模式。从配体激活的转录因子受体延伸到药物代谢酶系统，目前该领域已受到药物研发和药物安全性评价的广泛关注。最近几年，对于PXR作为内源及外源物激活受体在机体的防御机制中发挥着重要的生物调节作用和“解毒”功能。此外，大量研究还表明PXR受体能通过调节下游靶基因的表达而广泛参与机体的物质及能量代谢，并在某些疾病的发生发展中发挥重要的生理功能。随着对PXR功能研究的深入， 相信越来越多的激活PXR的天然产物新的药理作用会逐渐被发现。

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