柽柳与美人蕉RNA提取方法研究

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摘要：采用改良的CTAB法、SDS法和试剂盒法提取柽柳（Tamarix chinensis Lour）和美人蕉（Canna indica Linn）不同组织中的rna，通过紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳对提取的RNA质量进行检测。结果表明，CTAB法从柽柳和美人蕉叶中提取的RNA A260 nm/A280 nm分别为1.96和1.91，纯度较高。琼脂糖凝胶电泳结果显示CTAB法和SDS法提取的植物RNA 28 S rRNA和18 S rRNA条带清晰明亮，说明提取的RNA完整性好，浓度较高；而试剂盒法提取的植物RNA存在降解现象和杂质干扰。

关键词：RNA；提取方法；柽柳（Tamarix chinensis Lour）；美人蕉（Canna indica Linn）

中图分类号：Q522；S793.5；S682.2+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2177-04

提取纯度高、完整性好的RNA是cDNA文库构建、Northern印迹杂交分析等分子生物学研究的基础[1-3]。不同植物或同种植物不同组织中所含的化学成分有很大差别，因此RNA的提取方法也不尽相同[4，5]，实验时要求根据不同植物的特点选择适宜的RNA提取方法。柽柳（Tamarix chinensis Lour）为柽柳科柽柳属灌木或小乔木，具有较强的抗盐、抗旱胁迫，耐沙埋、耐贫瘠、耐高温等特性[6，7]。美人蕉（Canna indica Linn）为美人蕉科美人蕉属植物，对重金属有较好的耐受与富集能力，是优良的环境监测与修复植物。本研究对传统的CTAB法、SDS法进行适当改良，并与试剂盒法一起，对柽柳和美人蕉不同组织中的RNA进行提取和检测，对各方法的优缺点进行比较分析，旨在为这两种植物RNA的提取提供理论依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 植物样品采集 鲜柽柳茎、叶、子和鲜美人蕉花、叶、茎于2011年8月采自湖州师范学院校园内植物种植基地。

1.1.2 仪器和试剂 主要仪器有UV-1100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、Sigma 3-18K型高速冷冻离心机（德国Sigma公司）、DYY-4C型电泳仪（北京六一仪器厂）、WH-966型调速混合器（太仓市科教器材厂）等。RNA提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；巯基乙醇、Tris-酚、Tris-HCl、氯仿、无水乙醇、LiCl、NaAc、CTAB、SDS等均购自国药集团化学试剂有限公司；DEPC购自生工生物工程（上海）有限公司；液氮购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 RNA的提取

RNA提取方法在文献[8]的基础上进行改良。

1.2.1 CTAB法 将0.8 mL硼砂-CTAB提取缓冲液加入到2 mL离心管中，加入80 μL β-巯基乙醇；将0.15 g新鲜植物样品用液氮冷冻研磨后迅速转到温浴过的离心管中，剧烈振荡离心管，将组织与提取液充分混匀，65 ℃温浴6 min后迅速置于冰上；待冷却后加入提取液1/2体积的Tris-酚及1/2体积的氯仿，涡旋振荡器剧烈振荡2 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液重复抽提一次；向上清液中加入等体积氯仿，振荡1 min，12 000 r/min离心8 min，取上清液，加入1/2体积无水乙醇、与上清液等体积的4 mol/L LiCl，混匀，冰浴沉淀0.5 h，12 000 r/min离心10 min，移弃上清液，用75%（体积分数，下同）的乙醇洗涤沉淀两次，离心分离后用SSTE溶液[1.0 mol/L NaCl、0.5% SDS、10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、2.5 mmol/L EDTA]溶解沉淀，加等体积氯仿-异戊醇（体积比为24∶1，下同）抽提一次后，加2 mol/L的NaAc溶液和2倍体积无水乙醇冰浴沉淀0.5 h，12 000 r/min离心10 min，沉淀用无水乙醇洗涤2次，离心分离后沉淀加入适量DEPC水溶解，即获得RNA的水溶液。

1.3 RNA质量检测

1.3.1 紫外分光光度法 用紫外分光光度法检测RNA纯度。取少量待测RNA样品，用蒸馏水稀释50倍，以蒸馏水作空白对照，测定其在260 nm和280 nm波长处的吸光度，并计算A260 nm/A280 nm；纯RNA样品的A260 nm/A280 nm约为2.0，低于2.0可能有蛋白质或酚类物质污染。

1.3.2 琼脂糖凝胶电泳 另取2 μL RNA提取样品，用0.8%非变性琼脂糖凝胶电泳检测（90 V、20 min），在紫外灯下观察并拍照，电脑保存样片。

2 结果与分析

2.1 紫外分光光度法检测结果

紫外分光光度法检测结果见表1。由表1可知，用CTAB法和SDS法提取柽柳和美人蕉叶中RNA，测得A260 nm/A280 nm介于1.8～2.0之间，说明所获得的RNA纯度较好，蛋白质、糖等杂质存在较少。3种方法从柽柳茎、子及美人蕉花、茎中提取的RNA A260 nm/A280 nm都低于1.8，说明RNA纯度低、杂质较多。用试剂盒法从两种植物不同组织中提取的RNA A260 nm/A280 nm均低于1.6，且RNA降解严重。SDS法与CTAB法相比，相同的植物组织用CTAB法提取的RNA纯度总体上高于SDS法，蛋白质和糖等杂质的污染较小。

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果

3 小结与讨论

提取植物组织RNA时常遇到一些问题，如RNA的产量很低或没有、RNA降解、酚类化合物的干扰、DNA的污染、多糖干扰、蛋白质干扰、未知物质的干扰（多为植物次级代谢物质）等[9-11]，需要根据不同植物组织的特点采取适宜的提取方法。采用改良的CTAB法、SDS法和试剂盒法提取柽柳及美人蕉组织中的RNA，以CTAB法从两种植物叶中提取的RNA质量最好，完整性好、纯度和产率高；其次是SDS法从植物叶中提取的RNA，采用试剂盒法提取的植物RNA纯度和产率均较低，存在杂质污染和降解现象。

同种植物不同组织由于所含化学成分的差异，提取RNA的方法也存在不同的难点[12]，RNA的提取效果也有差异。本实验中柽柳和美人蕉均是叶中的RNA提取比较容易，纯度、产量和产率都较高，且植物样品越鲜嫩提取效果越好。

CTAB法是以CTAB为变性剂，加入β-巯基乙醇使蛋白质变性、抑制RNase的活性，使用无水乙醇和LiCl沉淀总核酸和杂蛋白等，然后通过氯仿抽提和无水乙醇沉淀选择性地分离出RNA。对于富含多糖多酚类物质的植物材料，用CTAB作为阳离子表面活性剂成分可分离出高质量的RNA已经在很多植物中得到验证[9，10]。SDS法从柽柳和美人蕉组织中提取RNA的效果略差于CTAB法，可能是由于SDS法无法有效去除植物组织中的多糖、蛋白质等物质，电泳点样时存在飘样现象。试剂盒法虽然比较方便快速，但是在本实验中提取效果并不好，RNA产量很低且降解严重，相对成本较高，可见它有一定的局限性。

采用LiCl与无水乙醇共同作用沉淀RNA，效果较好，LiCl还可以去除胶质和多糖类物质，有效防止多糖物质对RNA提取和纯化的干扰。但用75%的乙醇洗涤2次后还会有Li+和Cl-残留在RNA的沉淀中，干扰RNA的反转录和体外翻译，如果多次用75%的乙醇洗涤又会降低RNA的产率。本研究采用NaAc溶液和无水乙醇冰浴沉淀的方法，使Li+和Cl-溶解于溶液中，有效地减少了Li+和Cl-污染。最后采用SSTE缓冲液溶解沉淀，并再次用无水乙醇冰浴沉淀，起到了较好的纯化作用。SSTE缓冲液中的Tris-HCl与NaCl组成缓冲体系，不仅起缓冲作用，还可防止RNA降解，EDTA能螯合金属离子，抑制RNA酶的活性，也起到防止RNA降解的作用。

增加氯仿抽提次数能有效去除蛋白质等杂质。采用酸酚不但可以抑制RNase的活性，而且在酸性条件下使蛋白质进入有机相，而RNA则进入水相，达到纯化的目的。洗涤沉淀用75%的乙醇，目的是去除盐离子的干扰，但由于水分的存在，多次洗涤将影响RNA产率。

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