基于高剪切分散乳化技术的黄芪中黄酮类化合物提取方法及动力学研究

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摘 要 [HTSS]利用高剪切分散乳化（High shear dispersing emulsifier，HSDE）技术为样品前处理方法，以甲醇为提取剂。通过单因素实验、L9（34）正交试验，优选出HSDE提取黄芪中4种黄酮类化合物（毛蕊异黄酮7OβD葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、芒柄花苷）的最佳条件为：料液比1∶20，转速16000 r/min，时间180 s。在此提取条件下进行黄芪提取的动力学研究，结果表明，黄芪中4种黄酮类化合物的HSDE提取过程符合准二级动力学方程特征，以时间（t）为横坐标，时间与峰面积的比值（t/A）为纵坐标，进行线性拟合，方程分别为：毛蕊异黄酮7OβD葡萄糖苷: y＝0.00974x＋0.00869，R2 ＝0.99736；毛蕊异黄酮: y＝0.00153x＋0.01654，R2＝0.9862；芒柄花素: y＝0.00196x＋0.02322，R2 ＝0.98492；芒柄花苷: y＝0.00527x＋0.046，R2＝0.99228。在实验的基础上推测其提取机理为气蚀效应、机械效应和剪切效应的协同作用。

[KH*3/4D][HTH]关键词 [HTSS]黄芪； 高剪切分散乳化提取； 高效液相色谱；动力学

[HT][HK]

[FQ（3２,X,DY－Ｗ][CD15] 20110816收稿；20111027接受

本文系中科院“百人计划”项目和国家自然科学基金（No.20974116）资助

* Email：didl@licp.省略[HT]

1 引 言

天然产物样品的前处理过程是建立其色谱分析方法的关键步骤。目前常用的样品前处理方法有回流提取法、索氏提取法、超声提取法、加压流体萃取法、微波辅助提取法、超临界CO2流体萃取法等\[1\]，以及近年来发展起来的固相微萃取、高速逆流色谱和液相微萃取等\[2～4\]。样品制备正向高效、快速、无污染或低污染的方向发展。

高剪切分散乳化（High shear dispersing emulsifier，HSDE）技术作为近年发展起来的一种均质化技术，已被应用到药物研究相关的诸多领域。如Ye等\[5\]用HSDE分散含伊曲康唑小球的固体制剂，以提高药物的溶解速率；Seo等\[6\]利用HSDE技术使乳糖化合物与聚乙二醇3000互相富聚，形成团聚物，并进而作为吸附剂使用；孙术国等\[7\]利用HSDE与微波辅助偶联提取鲜葛中葛根素，提取效率明显高于传统方法，并具有时间短、能耗小等优点，这为天然产物样品前处理方法的研究提供了极有价值的探索。

黄芪是豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根，具有抗菌、抗病毒、增强机体免疫力等药理学作用。研究表明，黄芪药理学作用的主要有效成分包括黄酮类、皂苷类、多糖类以及氨基酸类等\[8\]。其中，黄酮类化合物是其质量评价与控制的主要指标性成分，主要包括毛蕊异黄酮7OβD葡萄糖苷（Calycosin7OβDglucoside，CY）、毛蕊异黄酮（Calycosin，CL）、芒柄花素（Formononetin，FR）、芒柄花苷（Ononin, ON）等。

目前，对提取黄芪中黄酮类物质的样品前处理方法很多，如Qi等采用回流法提取黄芪中黄酮类成分\[8\]， Huang等采用超声提取\[9\]。这是两种中药材提取最常用的方法，但耗时较长，需要的溶剂量较大。Song等采用微波辅助提取，实验过程操作简便，耗时较短，提取效率高\[10\]。但微波提取有一定的局限性。Xiao等［11］用基质固相分散技术来对黄酮类化合物进行分离。此方法虽然对黄酮类化合物选择性较高，但实验的回收率较差，仅为83.0%，实验的RSD值则高达22.0%。冯祖飞等\[12\]以大孔吸附树脂技术为样品前处理方法，该方法虽具有较高的灵敏度和重复性，但前处理操作程序繁杂。

鉴于HSDE相对于传统提取方法所具有的显著优势，本研究以HSDE作为黄芪中黄酮类物质提取的前处理技术，以HPLCDAD作为检测手段，进行提取过程的动力学研究， 并探讨其提取机理，建立了HSDE样品前处理技术平台，以期应用到其它中药材的前处理过程中。2 实验部分

2.1 仪器与试剂

KQ500DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BT224S分析天平（德国Sartorius公司）；Fluko FA25高剪切分散乳化机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；Agilent 1200型高效液相色谱系统（G1311A二元泵，G1315D DAD检测器，ChemStation色谱工作站，（美国Agilent公司））；AT900柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；RODI TECHNOLOGY SPRING超纯水系统（厦门瑞思捷科学仪器有限公司）。对照品毛蕊异黄酮7OβD葡萄糖苷Calycosin7OβDglucoside，CY）、芒柄花苷（Ononin, ON）购自上海同田生物技术有限公司（纯度＞98%，HPLC Detection）；对照品毛蕊异黄酮（Calycosin，CL）、芒柄花素（Formononetin，FR）等为本实验室分离所得，经13 CNMR、1HNMR和MS结构鉴定，HPLC峰面积归一化法测定其纯度不低于98%。甲醇、甲酸（分析纯）；乙腈（色谱纯）。水为超纯水；黄芪饮片（市售，产自甘肃陇南），经粉碎机粉碎为黄芪粗粉，过分样筛（保证黄芪颗粒粒径≤200

SymbolmA@ m），备用。

分 析 化 学第40卷

第5期滑聚娜等： 基于高剪切分散乳化技术的黄芪中黄酮类化合物

提取方法及动力学研究

2.2 实验方法

2.2.1 高速剪切分散乳化提取装置 高速剪切分散乳化提取装置如图1所示。高剪切机工作原理见图2。由一对相互交错“配合”的定子和转子组合而成\[13\]。转子上有多把刀片,转子高速运转,速度可高达 10000～22000 r/min。转子高速运转时在底部产生负压,形成负压区,处于负压区的物料

被转子吸入到定子与转子之间狭窄的剪切“工作带”，即为定子与转子之间1

SymbolmA@ m间隙。定子固定不动,周边开有很多孔槽，物料在 1

SymbolmA@ m 间隙间受到强力作用,被剪切, 并加速向转子刀片的边缘运动，迫使它穿过定子孔槽喷射出去,碰到容器壁转弯返回到容器内混合物中。被剪切的物料再次受到转子底部负压的吸引,被吸入转子和定子间，受到强力作用,从而形成连续循环 \[14\]。

[TS（][HT5”SS] 图1 高速剪切分散乳化提取装置

Fig．1 Schematic diagram of high shear dispersing emulsifier （HSDE） extraction apparatus

1. 定子套筒; 2. 主轴; 3. 定子头; 4. 转子; 5. Eppendorf 管。1. Stator cartridge；2. Main shaft；3. Stator；4. Rotor； 5. Eppendorf tube.[HT][TS）]

[TS（][HT5”SS] 图2 剪切机的工作介质循环图（a） 及其工作原理示意图（b）

Fig 2 Circulation schematic diagram （a） and operation schematic diagram （b） of medium

1. 定子齿圈； 2. 转子齿圈； 3. 工作区； 4. 出口； 5 . 入口； 6. 定子与转子间隙。1. Stator gear ring; 2. Rotor gear ring; 3. Working space; 4. Inlet; 5. Outlet; 6. Clearance between rotor and stator.[HT][TS）]

2.2.2 样品前处理方法及条件的优选 分别取黄芪粉末0.2 g，各置入Eppendorf 离心管，加入适量甲醇作为提取剂，分别用超声波仪（功率:185 W，温度：室温）和HSDE（转速:10000 r/min，温度：室温）进行提取，合并提取液，用甲醇定容至5 mL，进行超声提取与HSDE提取的比较实验、单因素实验和正交实验。溶液过0.45

SymbolmA@ m滤膜，用高效液相色谱进行测定。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：SinoChrom ODSAP C18 液相色谱柱（大连依利特分析仪器有限公司）；流动相：0.3%甲酸（A），乙腈（B）；梯度洗脱：0～15 min，10%～25% B；15～20 min，25% B；20～35 min，25%～34% B；35～40 min，34%～45% B；40～50 min，45% B；50～54 min，45%～50% B. 流速：0.8 mL/min，检测波长：280 nm；温度：25 ℃；进样量：20

SymbolmA@ L。在此色谱条件下，样品色谱图见图3\[6\]。在图3中，4种目标化合物CY, ON, CL, FR色谱峰的标定，通过比较相应对照品的保留时间和DAD吸收特征确定。

[TS（][HT5”SS] 图3 黄芪HPLC色谱图

Fig．3 Chromatogram of Radix astragali samples

1. 毛蕊异黄酮7OβD葡萄糖苷（Calycosin7OβDglucoside，CY）; 2. 毛蕊异黄酮（Calycosin，CL）; 3. 芒柄花素（Formononetin，FR）; 4. 芒柄花苷（Ononin, ON）。[HT][TS）]

2.2.4 HSDE提取 过程的动力学研究 取黄芪粉末12.5 g，置入烧杯中，加入适量甲醇作为提取溶剂，在高剪切分散乳化机上分别于0, 30, 60, 90, 120, 150和180 s取样各100

SymbolmA@ L，样品溶液过0.45

SymbolmA@ m滤膜，按照2.2.3节色谱条件进行测定，测定结果进行动力学方程拟合与分析。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理方法的优选结果 在料液比1∶10，处理时间120 s条件下，按照2.2.2节样品前处理方法分别用超声提取和HSDE提取方法制备样品溶液，按照2.2.3节色谱条件进样分析。分别以超声提取和HADE对黄芪中4种目标化合物色谱峰比值为评价指标，结果见表 1。由表1可见，在相同的条件下，HSDE提取效率明显优于超声提取。本实验以HSDE

CY46.9108.843.11ON254.6344.173.99CL229.6310.973.85FR95.9127.575.22[BHDFG1*2,WKZQ0W] [BG）W][HT][]

提取作为样品前处理方法。

3.2 正交实验

在分别考察料液比、时间、转速的单因素实验基础上进行L9 （34）正交实验，正交表设计及实验结果见表2。方差分析的结果表明，除料液比对峰面积有显著影响外，其它因素的影响均无显著性意义，综合节能及仪器等因素确定的最佳提取条件为： 料液比1∶20，转速16000 r/min，时间180 s。

3.3 HSDE提取动力学过程

3.3.1 HSDE提取动力学方程 利用正交实验优选的样品前处理条件，对黄芪样品进行提取，在设定的时间点取样、分析，以时间（t）为横坐标，时间与峰面积的比值（t/A）为纵坐标,进行线性拟合，结果见图4。方程分别为：毛蕊异黄酮7OβD葡萄糖苷: y＝0.00974x＋0.00869，R2 ＝0.99736；毛蕊异黄酮: y＝0.00153x＋0.01654，R2＝0.9862；芒柄花素: y＝0.00196x＋0.02322，R2 ＝0.98492；芒柄花苷: y＝0.00527x＋0.046，R2＝0.99228。结果表明, 利用HSDE技术对黄芪中黄酮类化合物的提取过程符合准二级动力学。

3.3.2 HSDE提取时效关系 推测HSDE提取技术的提取机理为气蚀作用、机械效应和剪切效应协同作用的结果。正是在这3种效应的协同作用下，黄芪样品中的植物细胞被迅速破碎，绝大部分目标化合物在30 s左右被释放出来，达到快速提取的目的（见图5）。HSDE提取技术具有提取速度快、操作时间短、溶剂耗量少、收率高、无需加热等优点，是一种有很好巨大发展前景的样品前处理方法。

References

1 Rostagno M A, Villares A, Guillamón E, GarcíaLafuente A, Martínez J A. J. Chromatogr. A, 2009, 1216 （1）: 2～29

2 Beltran J, Lopez F J, Hernandez F. J. Chromatogr. A, 2000, 885（12）: 389～404

3 LI Ning, HUANG GuangLiang, LI YuLan, WANG TieJie, GAO ChongKai. Chinese J. Anal. Chem., 2009, 37（12）: 1791～1794

李 宁, 黄光亮, 李玉兰, 王铁杰, 高崇凯. 分析化学, 2009, 37（12）: 1791～1794

4 DI DuoLong, ZHENG YuanYuan, CHEN XiaoFen, HUANG XinYi, FENG ShiLan. Chinese J. Anal. Chem., 2011, 39（2）: 269～275

邸多隆, 郑媛媛, 陈小芬, 黄新异, 封士兰. 分析化学, 2011, 39（2）: 269～275

5 Ye G H, Wang S L, Heng P, Wan S, Chen L, Wang C. International Journal of Pharmaceutics, 2007, 337（12）: 80～87

6 Seo A, Holm P, Kristensen H G, Schaefer T. International Journal of Pharmaceutics, 2003, 259 （12）: 161～171

7 SUN ShuGuo，MA ChengJin，HUANG Qun，GU RenYong，LUO ZhiQiang. Food Science，2009，30（22）: 50～53

孙术国, 麻成金, 黄 群, 顾仁勇, 罗志强. 食品科学, 2009, 30（22）: 50～53

8 Qi L W, Yu Q T, Li P, Li S L, Wang Y X, Sheng L H, Yi L. J. Chromatogr. A, 2006, 1134（12）: 162～169

9 Huang X, Liu Y, Song F R, Liu Z Q, Liu S Y. Talanta, 2009, 78（3）: 1090～1101

10 Song J Z, Mo S F, Yip Y K, Qiao C F, Han Q B, Xu H X. Journal of Separation Science, 2007, 30（6）: 819～824

11 Xiao H B, Krucker M, Albert K, Liang X M. J. Chromatogr. A, 2004, 1032 （12）: 117～124

12 FENG ZhuFei, SUN XiaoMing, NING ShengRong, SHI YanPing, DI DuoLong. Journal of Chinese Medicine Materials, 2010, 33（9）: 1425～1427

冯祖飞, 孙小明, 宁生荣, 师彦平, 邸多隆. 中药材, 2010, 33（9）: 1425～1427

13 DENG XiaoMing, WANG XiKui, ZHANG YuZhong. Chemical Production and Technology, 2004, 11（4）: 17～19

邓晓明, 王习魁, 张裕中. 化工生产与技术, 2004, 11（4）: 17～19

14 LONG Wei, SONG ZheYu, LU ZhongYi. High ways & Automotive Applications, 2009, 3（5）: 204～207

陇 伟, 宋哲玉, 陆忠义. 公路与汽运, 2009, 3（5）: 204～207

Extraction Kinetics Research of Flavonoids from Radix Astragali

Based on High Shear Dispersing Emulsifier

HUA JuNa1,2, FENG ZuFei2,3, LIU YongFeng2,3, PEI Dong2,

SUN XiaoMing2, FENG ShiLan1, DI DuoLong*1,2

1（Pharmaceutical College, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China）

2（Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural

Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics,

Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China）

3（Graduate University of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Abstract Four kinds of flavonoids compounds（Calycosin7OβDglucoside, Calycosin, Formononetin, Ononin） were extracted from Raidx astragali by high shear dispersing emulsifier technique （HSDE） as a pretreatment method and using methanol as the extraction solvent. The results demonstrate that HSDE is superior to ultrasonic extraction. The optimal extraction conditions were selected by single factor experiments and L9 （34） orthogonal experiments, which included the solidliquid ratio of 1∶20, 180 s extraction time and rotate speed of 16000 r/min. Then the extraction kinetics was studied under the optimal conditions. The results show that the HSDE extraction process of the four kinds of flavonoids compounds from Raidx Astragali follows the pseudosecondorder equation. Taking time （s） as horizontal axis and the ratio of time to peak area （t/A） as the longitudinal axis, the data was linearly fitted. The equations are Calycosin7OβDglucoside: y＝0.00974x＋0.00869 （R2＝0.99736）; Calycosin: y＝0.00153x＋0.01654 （R2＝0.9862）; Formononetin: y＝0.00196x＋0.02322 （R2＝0.98492）; Ononin: y＝0.00527x＋0.046（R2＝0.99228）. On the basis of the results of our experiments, it is inferred that the extraction mechanism involves the cooperative action of cavitation, mechanical and shear effect.

Keywords Radix astragali; High shear dispersing emulsifier; High performance liquid chromatography; Kinetics

（Received 16 August 2011; accepted 27 October 2011）

第40卷2012年5月 分析化学 （FENXI HUAXUE） 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期757～761

[BW（B（S*3/4,0,）][CD44][BW）]

DOI： 10.3724/SP.J.1096.2012.10760