新城疫病毒(NDV)对卵巢癌细胞株(SKOV-3)的杀伤作用

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[摘要] 目的 研究新城疫病毒（ndv）对卵巢癌细胞株（skov-3）的杀伤作用。方法 用不同浓度新城疫病毒（NDV-D90）与卵巢癌细胞株（SKOV-3）共培养；在不同时间（6、12、24、48h）观察SKOV-3细胞形态的改变。结果 NDV病毒作用的SKOV-3细胞表现为细胞膜皱缩、细胞核染色质浓缩、细胞溶解和细胞凋亡；NDV可对SKOV-3胞产生抑制作用，抑制效果与浓度及共同孵育时间有关，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 NDV对体外培养SKOV-3细胞增殖有明显抑制作用，并可诱导该细胞凋亡。

[关键词] 卵巢癌；NDV；细胞培养

[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）23-25-02

The Effect of Newcastle Disease Virus-infected（NDV） on the SKOV-3

SU Lirong

Obstetrics and Gynecology Department，Beijing Municipal Shunyi District Women and Children Health Care Hospital ， Beijing 101300，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of newcastle disease virus-infected（NDV） on the SKOV-3. Methods NDV-D90 in different concentration was cultured with SKOV-3； The SKOV-3 cells were monitored for cell morphological changes under micro scope within 6hours， 12hours，24hours and 48hours respectively. Results The SKOV3 cells infected by NDV become shrinked，dissolved. Cell concentration and apoptotic bodies were observed as well. NDV could effectively inhibit SKOV-3 cell growth， which depends on virus concentration and inoculation time of NDV and the difference of cell growth inhibitory rate among cells was significant（P＜0.01）. Conclusion NDV can inhibit proliferation and induces cell apoptosis in SKOV-3 cells in vitro.

[Key words] Ovarian cancer； NDV；Cell culture

卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，且手术和放化疗疗效不佳，5年生存率较低，成为严重威胁妇科肿瘤患者生命的疾病。卵巢癌传统的治疗常难以治愈，且易复发。因此寻找特异性强、敏感性高的卵巢癌相关抗原，并探索有效的综合治疗方法有重要的临床意义。肿瘤基因治疗给肿瘤治疗技术带来了新生机，供选择的基因有[1]：细胞因子基因、主要组织相容性复合体基因、病毒基因和反义基因。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是近年来兴起引起重视的一种病毒，作为病毒基因，它对多种恶性肿瘤具有一定治疗作用。 2010年3月~ 2011年1月本研究对此课题进行探讨，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肿瘤细胞株卵巢癌细胞株SKOV-3购自哈尔滨市肿瘤医院细胞生物所；主要试剂新城疫病毒（NDV-D90）、胎牛血清、RPMI1640培养液、台盼蓝、AO-PI染剂；实验仪器超净工作台（苏州净化集团安泰公司）；CO2细胞培养箱（上海跃进医疗器械厂）；倒置显微镜（OLYMPUS-CK2，Japan）；自动双重纯蒸馏水器（上海强申生化仪器厂）；电热恒温水浴箱（北京医疗设备厂，GB11241-89）；透射电镜（日产JEM-1230型）；荧光显微镜；光学显微镜（OLYMPUS，Japan）；离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养细胞用RPMI1640培养基，加入10%小牛血清、100U/mL青霉素及链霉素100μg/mL，细胞呈贴壁生长。于37℃、5%CO2饱和湿度条件孵箱孵育，每2～3天换液一次。传代培养时，将处于对数生长期的细胞弃尽培养液，加入新鲜的0.25%胰酶消化37℃孵育5min，待细胞脱壁后加入新鲜的含小牛血清的培养液中止胰酶反应，抽提重悬细胞，分置细胞于新的培养瓶中，传代比例为1∶3；制成细胞悬液，离心后加培养液10mL重悬细胞，取0.5mL进行活细胞计数，反复计数三次， 分装于培养瓶中，放入孵育箱中备用。生理盐水洗涤两次，将细胞调整为4×107/mL。

1.2.2 受试药物的配置 NDV在鸡胚尿囊液中培养扩增，置37℃恒温箱中72h后取出，4℃冰箱过夜，7520rpm离心15min，取上清液，用HBSS液溶解沉淀，双蒸水稀释蔗糖成20%~55%梯度，在4℃，75000rpm离心2h，从蔗糖界面抽吸出纯化的病毒，测定NDV浓度为2×108PFu/mL，用PBS液稀释为108PFu/mL，将病毒分装冻存。NDV-D90是一种新分离强毒株，血凝效价2×108PFU/mL和2×109PFU/mL，由哈尔滨兽医研究所提供。实验分组和处理将制备好细胞悬液分5个处理组分别接种于培养瓶、6孔培养板和96孔板上，尽量吹打均匀，并做对照，再分别加NDV病毒原液500μL（约含病毒颗粒2×108/PFU）放于37℃、5%CO2培养箱中，分别于6h、12h、24h、48h分别观察细胞生长及死亡情况，并用台盼蓝染色计数死细胞数，计算细胞存活率。培养24h取出6孔培养板固定，晒干24h中性树脂封片备用。NDV稀释10倍组：NDV50μL稀释10倍，其余同NDV原液组。NDV稀释100倍组：NDV5μL给予稀释100倍，其余同NDV原液；光学显微镜观察肿瘤细胞的凋亡和计算贴壁率，台盼蓝检测肿瘤细胞存活率， 细胞存活率（%）=（细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数×100%；AO-PI染色法（丫啶橙染色法及活细胞染色）进行形态观察和指标检测，荧光检测细胞凋亡。电镜检查当CPE（细胞病变试验）达80%弃去维持液，用橡皮垫扫刮取细胞，收集于5mL的EP管中固定，3000r/min离心10min，送电镜室透射电镜观察细胞内病毒颗粒和细胞超微结构变化。凋亡细胞半定量分析400高倍视野下，每个培养瓶拍摄5个阳性视野，每视野计数200个肿瘤细胞中的阳性细胞数，以平均计算阳性细胞数所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数[（AI）=（凋亡阳性的细胞核数÷总计数的细胞核数）×100]。

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1.3 结果判定

吖啶橙染色后荧光显微镜下见NDV作用的癌细胞细胞质与细胞核呈致密浓染的黄绿色荧光或见黄绿色碎片，亦有少数黄绿色碎片，染色质浓缩到核边，核碎裂，有的细胞形成合胞体；PI染色荧光显微镜下见正常活细胞核被PI着染呈红色；早期凋亡细胞胞核浓缩，染色加深，或核染色质聚集于核膜一边，呈新月状；晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小不等的原形小体，并被细胞膜所包绕，即凋亡小体。病毒作用24h后电镜下观察细胞中发现凋亡小体，同时也见典型的坏死细胞。

1.4 统计学方法

采用SPSS统计软件进行数据处理，运用配对t检验或χ2检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 新城疫病毒（NDV）对人卵巢癌细胞株（SKOV-3）不同作用时间杀伤作用

肿瘤细胞贴壁率光镜选择3个视野观察肿瘤细胞贴壁率，随NDV作用时间的延长，肿瘤细胞萎缩、脱落、最后悬浮，贴壁率显著下降（表1）。

2.2 两组肿瘤细胞存活率与贴壁率相比

肿瘤细胞存活率与贴壁率相比，存活率高于贴壁率，实验组与对照组存在显著性差异（P＜0.01）。

2.3 肿瘤细胞的光镜观察

NDV病毒处理24h后人卵巢癌细胞株SKOV-3见细胞体积减少细胞膜皱缩，形态不规则，溶解核小体出现，核染色质浓缩在核膜下或核的一边， 可见细小的碎片，出现大面积细胞凋亡。未经NDV病毒处理的SKOV-3细胞只见少许凋亡细胞。

2.4 电镜检查

感染病毒48h细胞作超薄切片、透射电镜观察，见NDV作用后SKOV3细胞形态改变，肿瘤细胞感新城疫病毒后，可引起明显的细胞超微结构变化：细胞胞浆内均富含不同发育阶段的病毒颗粒，完整病毒粒直径约100nm，并形成包涵体；成熟病毒粒子排列成晶格状，线粒体肿胀、细胞膜溶解；亦见到核膜结构完整，但核染色质浓缩、成块、边聚、滑面内质网扩张的细胞，尚可见到大量的病毒空衣壳和未包装的病毒核物质。见图1。

图1 NDV 诱导SKVO-3细胞发生细胞凋亡的形态改变（×50 000）

A：未感染NDV的SKOV-3细胞； B：NDV作用48h的SKOV-3细胞；C：未感染NDV的SKOV-3细胞；D：NDV作用48h的SKOV-3细胞

2.5 AO-PI染色法检测凋亡细胞

AO-PI染色法检测凋亡细胞感染病毒24h的细胞经AO-PI染色法后，肿瘤细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈棕褐色。新城疫病毒作用24h凋亡细胞阳性指数（AI）为9.9%，48h凋亡细胞阳性指数（AI）为17.8%。

3 讨论

NDV 是新城疫病毒（NDV），属副黏病毒科腮腺炎病毒属成员，属反义负链RNA病毒，由 Doyle[2]在1927 年首先发现和分离报道。本研究将NDV与人卵巢癌细胞株混合，研究其对人卵巢癌细胞株和正常人卵巢上皮细胞的生长抑制作用。结果表明NDV对人卵巢癌细胞有抑制作用，对人正常卵巢上皮细胞作用不明显，提示NDV在体内可能有安全性好、副反应小的优越性。NDV对绝大多数肿瘤有选择性直接杀伤作用，国外将NDV应用于临床未发现毒性反应。本实验进一步确定新城疫病毒的抗肿瘤作用，直接用新城疫病毒观察其体外抗肿瘤作用，研究表明，新城疫病毒在体外可抑制瘤细胞的存活。NDV对卵巢癌有直接的抑瘤作用，使NDV有望在控制卵巢癌微小残余灶、延缓复发、提高生存期和生存质量等方面发挥作用。NDV具有直接诱导肿瘤细胞凋亡及激活免疫功能细胞，NDV诱导肿瘤细胞凋亡或瘤体消退的机制尚不十分清楚，可能的解释：①NDV直接作用于肿瘤细胞产生细胞毒作用，病毒选择性地作用于肿瘤细胞，对正常组织细胞不起作用。Tzadok-David等[3]研究了NDV对Burkitt淋巴瘤Daudi细胞的破坏作用，发现NDV对肿瘤细胞的裂解机制可能与细胞膜的通透性增加有关。② NDV蛋白与肿瘤细胞膜部分或完全融合，诱导和加强宿主的细胞免疫及体液免疫杀伤肿瘤细胞。③NDV对体内外巨噬细胞抗肿瘤活性具有很强的激活作用；NDV能选择性地感染肿瘤细胞并在其中复制，不感染正常细胞。本实验利用NDV-D90强毒株作用于人卵巢癌SKOV3，发现NDV有明显的抑制肿瘤作用。蒋文军等选用NDV Lasota毒株感染多个人恶性肿瘤细胞株，亦得出相同结果。

综上，新城疫病毒（NDV）促进SKOV3卵巢癌细胞凋亡，对卵巢癌组织具有溶瘤作用，使新城疫病毒成为手术、化疗之外的新选择。

[参考文献]

[1] 成军.抗肿瘤基因治疗的目的基因选择[J]. 国外医学：肿瘤学分册，1994，21（1）：6.

[2] 陈兆.医学分子生物学[M].武汉：武汉大学出版社，1987：50-52.

[3] Fabian Zm，Torocsik B，Kiss K. Induction of apoptosis by a New-ca-stle disease virus vaccine （MTH-68/H） in PC12 rat phaeochromocyt-oma Cells[J].Anticancer Res，200l， 22（14）：125.

[4] Pavel I. Nedvetsky， William C. Sessa，and Harald HH W. Schmidt. There's NO binding like NOS binding：Protein-protein interactions in NO/cGMP signaling[J].PNAS， 2002， 99 （26）： 16 510-16 512.

[5] 蒋文军，魏阳新.新城疫病毒Lasota弱毒株对人肿瘤细胞的体外修饰作用[J].肿瘤防治研究，2007，34（4）：281-283.

（收稿日期：2011-05-23）

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