了哥王抗肿瘤活性部位筛选
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摘 要：目的：研究了哥王95%、75%、50%乙醇提取物、水提物及95%乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位对肿瘤细胞的增殖抑制作用，确定了哥王抗肿瘤活性部位。方法：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法考察了哥王不同提取物及95%乙醇提取物的不同溶剂萃取部位对Hela、SGC-7901、Bel-7402细胞的抗肿瘤活性。结果：了哥王95%乙醇提物对Hela、SGC-7901细胞有良好的抗肿瘤活性，其石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部位对Hela、SGC-7901细胞均有不同程度的抗肿瘤活性。结论：石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部位有较强的抗肿瘤活性，初步确定为了哥王抗肿瘤活性部位。
关键词：了哥王；抗肿瘤活性；活性部位
中图分类号：R284.2；R285
文献标识码：A文章编号：
1673-7717（2008）11-2520-03
Preliminary Study on Anti-tumor Effect of Extracts of Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.
CHEN Yang, LI Yanchun, MA Enlong, SUN Lixin
（School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，Liaoning,China）
Abstract：Objective：To estimate the anti-tumor activity of different extracts and different parts of 95% ethanol extracts of Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey. Methods：MTT assay was applied to screen the anti-tumor effect of the extracts of Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey. on 3 tumor cell lines in vitro．Results：95% ethanol extracts had strong inhibitory effect on different tumor cell lines．The anti-tumor activity of petroleum part, chloroform part and ethyl acetate part are various in vitro．Conclusion：Petroleum part, chloroform part and ethyl acetate part，which are considered as activity parts of Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.，have considerable cytotoxic effect．
Key words：Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.；anti-tumor activity；activity parts
了哥王［Wikstroemia indica (L.) C. A. Mey.］为瑞香科荛花属植物，又名南岭荛花，性寒，味苦，微辛，有毒，归肺肝经。产于我国广东、广西、福建、海南、浙江等省区，具有清热解毒、消肿散结、止痛等功效。临床用于抗菌、抗病毒、治疗肺癌等多种病证[1]。有文献报道了哥王水煎剂对小鼠子宫颈癌、P388淋巴细胞性白血病有明显抑制作用[2]。了哥王所含西瑞香素可抑制艾氏腹水癌细胞的核酸与蛋白质合成，南荛素类化合物、牛蒡苷元、罗红松脂酚均有抗白血病的作用。另外，了哥王含有的两种黄酮类化合物苜蓿素和山柰酚-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷能抗P388淋巴细胞性白血病和抗HVI-1[3-5]。
本实验采用MTT法研究了哥王95%、75%、50%乙醇提取物、水提物及95%乙醇提取物的不同溶剂萃取部位对肿瘤细胞的抗肿瘤活性，初步确定了哥王抗肿瘤活性部位。
1 仪器和材料
1.1 仪器与试剂
MCO-18AIC型二氧化碳培养箱(日本三洋)；BCN-1360B型生物洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；SPECTRA MAX plus型酶标仪(Molecular Devices公司)；RPMI1640(GIBCO invitregen corporation Lot. No. 1285082)； 胎牛血清(天津TBD公司Lot.No.0701-3100)；二甲基亚砜(天津市博迪化工有限公司)；MTT[溴化-3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基四氮唑](美国Sigma)；5-Fu标准品由王晶老师惠赠。
1.2 药材 了哥王药材饮片购于河北安国市童铃药材有限公司，由沈阳药科大学孙启时教授鉴定。
1.3 细胞株人宫颈癌Hela细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞、人肝癌Bel-7402细胞为贴壁细胞，均由本实验室传代保种。
2方 法
2.1 样品溶液制备 了哥王饮片分别用95%、75%、50%乙醇和水回流提取3次，每次1h，浓缩得相应浸膏。
用少量水将95%乙醇提取物浸膏分散依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂得不同溶剂萃取部位浸膏。
取95%、75%、50%乙醇提取物、水提取物和95%乙醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位浸膏适量，溶于DMSO中，加药前用培养液稀释成300、100、30、10μg•mL-1。
2.2阳性药5-Fu的制备 以微量DMSO溶解5-Fu标准品，加药前用培养液稀释成50、10、2、0.4μg•mL-1，培养液中DMSO终浓度不超过3‰。
2.3 细胞培养 以RPMI-1640培养基作为基础配制成内含10%FBS、100U•mL-1青霉素和100μg•mL-1链霉素的细胞培养液。在浓度为5% CO2的37℃培养箱中传代培养。待细胞生长达到对数生长期即可用于实验。
2.4 体外增殖抑制实验采用MTT法。取对数生长期的Hela、SGC-7901、Bel-7402细胞，分别以4×104、5×104、6×104 cells•mL-1密度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24h后加药，给药组剂量为300、100、30、10μg•mL-1。阳性对照组给药剂量为50、10、2、0.4μg•mL-1。同时设阴性对照组及空白组。每组均设3复孔，每孔加药100μL。培养48h后，除去培养液及药液，每孔加5 g•L-1MTT 10μL和培养液100μL，继续培养4h，除去培养液及MTT，每孔加DMSO 150μL，微型振荡器振荡10min，用酶标仪在λ492nm 下测OD值，计算抑制率、IC50值[6]（注：IC50为半数有效抑制浓度）。
生长抑制率% =〔(对照组平均OD值-用药组平均OD值) /（对照组平均OD值-空白组平均OD值）〕×100%
3结果
了哥王95%、75%、50%乙醇提取物及水提物对3种肿瘤细胞的增殖抑制结果见表1。了哥王95%乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位对3种肿瘤细胞的增殖抑制结果见表2。
4 结论与讨论
从表1可知：了哥王95%、75%、50%乙醇提取物及水提物对Hela、SGC-7901细胞较敏感，对Bel-7402细胞不敏感。且了哥王95%乙醇提取物抗肿瘤活性好于其它3种提取物。
进一步考察了95%乙醇提取物的不同萃取部位的抗肿瘤活性。从表2可知：石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位抗肿瘤活性存在差异。石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部位对Hela、SGC-7901细胞抗肿瘤活性强。从IC50值看，Hela细胞：石油醚（93.86±5.42）>乙酸乙酯（101.21±4.68）>氯仿（112.06±3.20）萃取部位；SGC细胞：乙酸乙酯（63.66±1.52）>石油醚（72.57±0.21）、氯仿（72.93±6.29）萃取部位。
由此，可初步确定了哥王抗肿瘤活性部位为石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部位。
参考文献
[1] 谢宗万．全国中草药汇编(上册)[M]．2版．北京：人民出版社，1996：10-12.
[2] 李国雄．中药抗癌成分（综述）［J］．国外医学•药学分册，1985(3)：135.
[3] Kuo-Hsiung Lee, Kiyoshi Tagahara, Hideyo Suzuki， et al. Antitumor agents，49 tricin，Kaempferol-3-0 beta-D-glucopyranoside and (+ ) nortrachelogenin，antileukemic principles from wikseroemia indica [J]. Nat prod，1981，44 (5)：530-535.
[4] Toshihiko Hirano, Manabu Gotoh, Kitaro Oka. Natural flaronids and lignans are potent cytostatic agents against human leukemic HL- 60 cells[J]．Life Sci，1994，55 (13)：1061.
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[6] 徐叔云，卞如濂，陈修，等．药理实验方法学[M]．北京：人民卫生出版社，1982：1785-1786.