活血行气方药物血清对SGC-7901人胃癌细胞Mg【sup】2+【/sup】-ATP酶 G-6-P酶活性影响的实验研究

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摘 要：目的：观察活血行气方药物血清对sgc-7901人胃癌细胞mg【sup】2+【/sup】-atp酶、g-6-p酶活性的影响。方法：采用酶细胞化学染色方法检测SGC-7901人胃癌细胞Mg【sup】2+【/sup】-ATPase、G-6-Pase活性。结果：药物血清组Mg【sup】2+【/sup】-ATP酶和G-6-P酶的酶反应颗粒变小,数量减少,密度减低,活性下降,明显低于对照组（P

关键词：活血行气方；Mg【sup】2+【/sup】-ATP酶；G-6-P酶；SGC-7901人胃癌细胞

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0894-03

Effects of Huoxuexingqi Formula on the Activity of G-6-Pase and

Mg【sup】2+【/sup】-ATPase of the Human Stomach Cell Line SGC-7901

QU Ting-ting【sup】1【/sup】, XU Da-zhao【sup】1【/sup】, CAI Yu-wen【sup】2【/sup】

（1.Liaoning University of TCM, Shenyang 110847, Liaoning, China

2.Dalian Center for ADR Monitoring，Dalian 116021, Liaoning, China）

Abstract:Objective: To observe the effect of Huoxuexingqi formula on the activity of Mg【sup】2+【/sup】-ATPase and G-6-Pase of Human Stomach Cell Line SGC-7901. Method: Enzyme cytochemistry was used to detect the activity of Mg【sup】2+【/sup】-ATPase and G-6-Pase of the Human Stomach Cell Line SGC-7901. Result：The response granules of Mg【sup】2+【/sup】-ATPase and G-6-Pase in the Human Stomach Cell Line SGC-7901 became smaller after the treatment of the Huoxuexingqi formula, the amount of the granules became fewer, the density was lower, The activity of the enzyme decreased obviously Significantly lower than the control group （P

Key words:Huoxuexingqi；G-6-Pase；Mg【sup】2+【/sup】-ATPase；Human Stomach Cell Line SGC-7901

收稿日期：2010-11-14

作者简介：曲婷婷（1979-），女，博士研究生，研究方向：中药抗肿瘤机理研究。

通讯作者：蔡玉文（1944-），男，教授，博士研究生导师，研究方向：中医药调控肿瘤免疫。

中药抗肿瘤是我国医学的一大特色，活血化瘀行气是中医治疗肿瘤的一个重要原则。本方主要由三棱、莪术、桃仁、红花等活血化瘀药配以赤芍、甘草行气缓急，对于改善胃癌中晚期肿胀、腹满、疼痛等症状有一定的作用。本实验通过对SGC-7901人胃癌细胞株酶活性影响来研究活血行气方抗肿瘤作用的机制。

1 实验材料

1.1 细胞株

人胃癌SGC-7901细胞株，由中国医科大学细胞培养室提供。

1.2 动物及试剂

SD大鼠30只，雌雄各半，体重180g～220g，由辽宁中医药大学动物室提供。活血行气方（三棱、莪术、桃仁、红花等）、化疗药物顺铂（DDP）均辽宁中医药大学药局提供。

1.3 药物血清制备

传统方法煎制,浓缩为100%。按成人1天用量定容为65mL折算,按成人65kg体重剂量的10倍量灌胃,即中药1mL/100g大鼠；对照组给予相同剂量生理盐水。给药3天,末次给药后1～2h无菌条件下自下腔静脉采血,离心分离血清,56℃,30min灭活,-20℃保存备用。

1.4 实验分组及药物处理

随机分为正常血清对照组（对照组）,西药组,中药组，中西医结合组。（1）对照组：对照组大鼠血清加入RPMI1640培养液，浓度10%。（2）西药组：用含10%顺铂组大鼠血清RPMI1640培养液配制，DDP的终浓度为5μL/mL（小），10μL/mL（中），20μL/mL（大）。（3）中药组：临用前将中药组大鼠血清加入RPMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、20%。（4）中西医结合组：含中药浓度10%+DDP终浓度20μL/mL。将培养瓶、培养皿置于37℃, 5%，CO【sub】2【/sub】培养箱中培养,倒置显微镜下动态观察细胞形态, 24h后见细胞贴壁生长状态良好,弃培养液,分别加入各组血清,继续培养。培养24h后,取材制作标本。

2 实验方法

2.1 细胞培养及药物处理

待SGC-7901人胃癌细胞株形成单层，用0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清RPMI-1640培养液悬浮细胞，将细胞浓度调整为1×10【sup】5【/sup】/mL，将细胞接种于内置载玻片的2个6孔培养板中。培养24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入含药血清，设无含药的大鼠血清为对照组，继续培养，48h后，取材制作标本。

2.2 Mg【sup】2+【/sup】-ATP酶酶细胞化学染色方法

取出载玻片放入染色缸中，2%多聚甲醛磷酸固定液固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，加Na【sup】+【/sup】-ATPase孵育液37℃，孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵复染，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片。

2.3 G-6-P酶酶细胞化学染色方法

取出载玻片放入染色缸中，2%多聚甲醛磷酸固定液固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，加G-6-P酶孵育液37℃，孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵复染，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片。

2.4 结果判定及统计分析

采用motic image图像分析系统进行灰度测定，数据采用SPSS 13.0软件进行统计处理，实验结果以均数±标准差（±s）表示。

3 结 果

3.1 光镜下Mg【sup】2+【/sup】-ATP 酶 G-6-P酶酶细胞化学染色结果

在光镜下见对照组ATPase主要定位在细胞膜的内侧,黑色酶反应颗粒大小均匀,密度大,呈线状规则排列；G-6-Pase主要定位在细胞质内,酶反应颗粒粗大,排列密集,呈融合状,酶活性++；与对照组比较,各组Mg【sup】2+【/sup】-ATPase酶和G-6-Pase反应颗粒变小,数量减少,密度减低,有的为阴性。提示酶活性明显下降。见图1～6。

3.2 药物血清对人胃癌SGC-7901细胞株Mg【sup】2+【/sup】-ATP 酶 G-6-P酶的活性影响

中药组和中西医结合组与对照组Mg【sup】2+【/sup】-ATP酶、G-6-P酶活性比较，差异显著（P

表1 Mg【sup】2+【/sup】-ATPase、G-6-Pase平均灰度值

注：与对照组比较，*P

4 讨 论

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，是严重危害人们身体健康的主要疾病之一。由于我国人口的不断增长以及人群老龄化，每年新发病的绝对数正在上升【sup】［1］【/sup】。其具有起病隐匿、发展迅速、死亡率高的特点，往往一经发现已经处于中晚期，失去了手术根治的机会，因此胃癌的内科疗法正越来越受到人们的重视。中医中药已广泛应用于胃癌的综合治疗中，中药复方在中医基础理论的指导下，充分地体现了中医辨证论治和整体观的治则，突出了中医治癌的特色。活血化瘀是中医治疗肿瘤的一个重要原则。本方主要由三棱、莪术、桃仁、红花等活血化瘀药配以赤芍、甘草行气缓急，对于改善胃癌中晚期肿胀、腹满、疼痛等症状有一定的作用。

中药血清药理学是1988年首次被提出【sup】［2］【/sup】，近年来被广泛应用于中药抗肿瘤机理研究。本实验即利用该方法，应用光镜酶细胞化学方法观察活血行气方对SGC-7901人胃癌细胞株酶活性影响的研究【sup】［3-4］【/sup】。Mg【sup】2+【/sup】-ATPase是细胞质膜标志酶,主要定位于细胞膜内侧、内质网膜及线粒体表面也有散在分布。G-6-Pase是内质网标志酶,定位在内质网表面,是细胞内糖原异生作用中重要酶之一,其酶活性强度与内质网的多少及功能状态有关,被称为“代谢标志酶”之一。与对照组比较，镜下见施加处理因素组上述两种酶反应颗粒变小,数量减少,密度减低,P

研究活血行气方对SGC-7901人胃癌细胞株酶活性的影响,为中药复方治疗胃癌提供可靠的实验依据。中医药治疗肿瘤的特点在于对机体的多靶点、多环节、多层次的整体调节。随着现代医学研究手段的不断改进，各种先进研究手段在中医药抗肿瘤领域的广泛应用和深入,中医药治疗胃癌一定拥有更为广阔的前景。

参考文献

［1］ Pisani P,Parkin DM,Bray F,et al. Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990［J］.Int J Cancer,1999,83:18-29.

［2］ 刘海兴,蔡玉文,胡莹，等.胃癌康诱导SGC - 7901人胃癌细胞株调亡的实验研究［J］.中华中医药学刊, 2007，25（4）:741-743.

［3］ 蔡玉文，荣明，明彩霞，等. 人外周血淋巴细胞酶超微结构定位与活性研究［J］.中国组织化学与细胞化学杂志, 1999, 8 （3） : 311-314.

［4］ 蔡玉文,李宁, 张丽红，等. 人外周血淋巴细胞酶活性光镜细胞化学定位［J］. 解剖科学进展, 2004,10（2）:122-123.