高效液相测定血中谷氨酰胺的研究

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【摘要】 目的 探讨高效液相色谱法测定血中谷氨酰胺的含量。方法 固定相反相C18(规格：046 mm×250 mm)，流动相为50 mmmol/L醋酸缓冲液(pH为65)：乙腈(977∶ 23)，流速10 ml/min，柱温46℃，检测波长为254 nm，进样量取10 μl。结果 谷氨酰胺在浓度范围(005~260) μg/ml之间有良好的线性关系，r=09989，批间、批内变异系数分别为287%、258%，两种高低浓度的回收率分别为1029%、970%。结论 本研究方法专属性强、重复性好、结果准确，为血中谷氨酰胺的含量测定提供了科学、专属的方法。

【关键词】 高效液相色谱法；血清；谷氨酰胺

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作者单位：333000 江西省景德镇市第二人民医院药剂科 目前有很多研究显示，谷氨酰胺(GLN)为人体中大多器官与组织所需的特殊营养物质，故亦称“基本营养素”，系肠外营养的重要成分［1］。但GLN不溶于水，遇热不稳定等，因此只能经双肽键以丙氨酸与其结合，合成稳定丙氨酰谷氨酰胺的双肽分子，此双肽分子进入机体后可很快分解成单体的谷氨酰胺与丙氨酸，因此双肽键在人体中打开率对丙氨酰谷氨酰胺注射液在临床上应用的药效评价是十分重要。本文笔者通过测定血中GLN浓度及血清GLN健康者的参考值，分别对丙氨酰谷氨酰胺注射液(商品名：多蒙特，四川科伦药业股份有限公司，国药准字：H20043702)和另外丙氨酰谷胺酰胺注射液(国内某制药有限公司)，探索我院行腹部大手术患者采用经谷氨酰胺强化安全肠外营养后血清中的GLN浓度情况。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪(美国，490型紫外检测器，510型输液泵，U6K进样器，PICOTAG色谱柱，810色谱工作站)，微孔滤膜(美国，Millipore公司)。

乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯；谷氨酰胺标准品(美国Sigma公司)；异硫氰酸苯酯(美国Pierce公司)；丙氨酰谷胺酰胺注射液(四川科伦药业股份有限公司)；丙氨酰谷胺酰胺注射液(国内某制药有限公司)。

2 方法与结果

21 色谱条件 色谱柱为固定相反相C18(规格：046 mm×250 mm)，流动相为50 mmmol/L醋酸缓冲液(pH为65)：乙腈(977∶ 23)，流速每分钟10 ml，柱温46℃，检测波长为254 nm，进样量取10 μL。

22 标准溶液的制备 准确称取1845 mg GLN标准品，以50 ml超纯水溶解混匀，即得25 mmmol/L GLN标准溶液，于4℃可保存。准确量取20 μLGLN标准溶液加至100 μL患者的血清中，充分混匀，即为标准血清。另外加入超纯水20 μL于100 μL血清中，充分混匀，即为标准空白血清。标准血清与标准空白血清同时超滤，取滤液，分别为标准液与标准空白液。

23 待测血清样本液的制备 抽取100 μL患者血清进行超滤，得无蛋白超滤液，即为待测的血清样本液。

24 衍生反应 分别量取加入超纯水20 μl、20 μl三乙胺及140 μl无水乙醇加入异硫氰酸苯酯中，充分混匀，即得衍生试剂，需现配现用。准确称取355 mg磷酸氢二钠，加入450 ml超纯水进行溶解，以10%磷酸乙腈(95∶ 5)混合溶液调PH为74，加水定容至500 ml，充分混匀，即得样品稀释液，于4℃冰箱保存。分别量取20 μl处理过的血清，在真空条件下抽干，加入20 μl衍生试剂，在室温下进行反应20 min，然后再真空抽干，加入1000 μl的样品稀释液，混匀，量取10 μl进样。

25 线性关系考察 量取25 mmol/L GLN标准溶液，以超纯水对倍进行稀释，分别获得7个浓度：2500、1250、0625、0312、0156、0078与0039 mmol/L，各取20 μl，衍生和测定。横坐标为GLN浓度(C)，纵坐标为峰面积(A)，进行线性回归。结果显示GLN标准溶液在浓度范围(005~260)mmol/L之间有良好的线性关系，r=09989。

26 重复性试验 精密量取12份125 mmol/L GLN标准溶液，在上述色谱条件下进样，测得批间变异系数为287%，批内变异系数为258%。

27 干扰试验 取混合氨基酸标样(不含GLN)，分为两份，其中一份加至350 μmol/L的GLN中，两份均按照上述方法处理并进样。结果显示GLN峰保留时间为1109 min，其邻近2个峰分别为β丙氨酸(保留时间1233 min)、甘氨酸(保留时间1002 min)，GLN峰位置没有受到任何氨基酸及其他杂峰干扰。

28 稳定性试验 分别在衍生0、2、4、6 h精密吸取同一血清标本10 μl，进样测定，结果显示RSD =0020%，说明血清标本在室温6 h内的稳定性佳。

29 回收试验 分别取2份健康人群的血清，均按照找上述方法测定GLN浓度，分别获得结果为597、608 mmol/L，再分别加入125、0156 mmol/ L 两种高低浓度GLN标准溶液，各10 μl，混匀，依法测定GLN的浓度，计算回收率。结果显示两种高低浓度的回收率分别为1029%、970%。

210 血清GLN的参考值测定 取30份健康人群的空腹血清标本，均按照上述方法测定GLN浓度，获得结果(6168±679) μmol/L。

211 临床试验 选取我院行腹部大手术患者共30例，随机分为实验组与对照组，每组各15例。其中实验组患者于术前3天始采用用丙氨酰谷胺酰胺注射液(多蒙特，四川科伦药业股份有限公司)05 g/kg，连续治疗6 d；而对照组患者采用丙氨酰谷胺酰胺注射液(国内某制药有限公司)，用法同实验组。两组患者分别在术前3 d及术后3、7 d测定GLN浓度(见表1)。