绞股蓝皂苷对糖尿病肾病大鼠肾组织转化生长因子β1表达的影响
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摘要：目的：探讨绞股蓝皂苷对糖尿病肾病大鼠肾脏中转化生长因子β1(TGF－β1)表达的影响，以了解其对早期糖尿病肾病的防治作用和分子机制。方法：采用单侧肾切除加STZ注射法改良复制糖尿病肾病模型，实验分为正常组、模型组、治疗组(绞股蓝皂苷高、中、低浓度及人参皂苷Rb1对照组)，观察糖尿病肾病模型大鼠一般情况、生化指标、肾组织病理变化、肾脏中TGF－β1mRNA及蛋白表达水平。结果：治疗组一般情况、生化指标、肾组织病理变化均优于模型组，同时TGF－β1mRNA及蛋白表达水平也较模型组明显下调，其中中剂量组与人参皂苷Rb1对照组的作用相接近。结论：绞股蓝皂苷可用于治疗早期糖尿病肾病，其机制可能与下调TGF－β1高表达，减少肾小球系膜区EGM的积聚有关。
关键词：绞股蓝皂苷；糖尿病肾痛；转化生长因子β1；细胞外基质
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)09－1922－04
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的并发症之一，是其致死致残的主要原因，故早期治疗，延缓其进展，改善其预后至关重要。迄今为止，DN的发病机制尚未完全阐明，对其分子细胞机制的探讨是近年来研究的热点之一，转化生长因子β1(TGF－β1)是DN复杂的细胞因子网络中的核心因子。本研究通过观察绞股蓝皂苷对DN大鼠肾组织内TGF－β1表达的影响，以探讨其改善DN的作用机制。
1 材 料
1．1 动 物
健康SD大鼠60只(体重180－220g，雌雄各半，由浙江中医药大学实验动物中心提供)，实验期间自由饮水和摄食，适应性喂养1周，取血糖、尿蛋白阴性、健康状况良好者为实验对象。
1．2 药品与试剂
绞股蓝总甙片：陕西安康制药厂产品(批号：国药准字Z10970130)；人参皂苷Rb1：中国药品生物制品检定所提供；链脲佐菌素(streptomn，STZ)均由美国Sigma公司提供；PAS染色试剂盒由上海虹桥医用试剂研究所提供；兔抗大鼠TGF－β1单克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供；生物索标记的羊抗兔IgG由武汉博士德生物工程有限公司提供；即用型第二代免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；二氨基联苯胺(DAB)显色剂为华美生物试剂公司产品；RT－PCR反应试剂盒由日本Takara公司提供；Trizol裂解液由美国GIBCOBRL公司提供。
2 方 法
2．1 动物模型的建立与分组
60只大鼠中随机选取52只，按杨俊伟等单侧肾切除加STZ注射法改良复制DN模型。其余8只大鼠行左侧肾摘除假手术操作，然后按5mL／kg尾静脉注射pH4.4的柠檬酸缓冲液，作为正常对照组(F组)。将糖尿病肾病模型大鼠按性别、体重随机分为5组，每组8只，即绞股蓝皂苷高剂量组(A组：1g／kg)；中剂量组(B组：0.5g／kg)；低剂量组(C组：0.25g／kg)；人参皂苷Rbl组(D组：0.01mg／kg)；模型对照组(E组：灌胃等体积的生理盐水)。各组大鼠灌胃给药，每日1次，连续4周；正常对照组(F组)也灌胃等体积的生理盐水。
2．2 标本采集
各组大鼠于治疗第4周末以代谢笼留取24h尿液标本，用于测定尿蛋白；同时眼眶后静脉丛取血2－3mL，用于测空腹血糖、血肌酐、尿素氮(禁食不禁水12h)；然后全部颈椎脱臼处死，留取肾皮质，一半用于组织形态学化学检查，另一半用于RT－PCR。
2．3 检测指标
2．3．1 血糖与肾功能测定 血糖用葡萄糖氧化酶法测定，尿蛋白用考马斯亮蓝法测定，血肌酐、尿素氮均用日本日立7170型全自动生化仪测定。
2．3．2 肾脏病理组织学检查肾组织取材固定后。第3天更换10％中性甲醛溶液，1周后取出标本，进行修剪，然后冲水，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡后石蜡包埋。超薄切片机将肾组织切成3μm厚，供HE染色、PAS染色和免疫组织化学检查，光镜下观察肾组织病理形态学改变。
2．3．3 免疫组织化学检测肾组织TGF－β1的表达，采用ElivisionTMplus法，按试剂盒说明进行操作，显色剂为DAB。阳性结果判定：肾小球及肾小管间质区域见到淡黄色或棕黄色染色为阳性，应用真彩色病理图象分析系统软件进行。
2．3．4 RT－PCR检测TGF－β1。mRNA表达由基因库分别查得大鼠TGF－β1的mRNA核苷酸序列，Primer Premier计算机软件辅助引物设计，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，TGFβ1上下游引物分别为：5’－ACGCAATCTATGACAAAACC－3’和5’－TACCAAGGTAACGCCAGG－3’。取肾皮质100mg，加液氮研碎后，用Trizol提取总RNA，紫外分光光度计测量A260nm／A280nm，计算RNA纯度及浓度，甲醛变性凝胶电泳观察RNA有无降解。取总RNA2μg，按逆转录操作说明书逆转录成cDNA，取反转录产物及TGFβ1上下游引物各1μL，10x缓冲液4μL，10mmol／L dNTP 0.80μL，25mmol／L MgCl24μL，TaqD，NA多聚酶5U，加水至体积dOμL。反应条件为：94℃，3min；94℃，20s；60℃，20s；72℃，30s，30个循环，72℃，10min；4℃，5min。1.5％琼脂糖凝胶电泳，照相。
2．4 统计学分析
应用SPSS11.0统计软件，结果以x±s表示，进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。
3 结 果
3．1 一般情况
正常组(F组)大鼠体重增加明显，精神状态良好，反应灵敏，皮毛有光泽，动作自如。模型组(E组)大鼠具有典型“三多一少”的表现，且精神萎靡，反应迟钝，毛竖无光泽，动作迟缓，弓背蜷体。各治疗组(A、B、C、D组)大鼠表现较模型组明显减轻，B组与D组情况相似。
3．2 绞股蓝总皂甙片对糖尿病肾病大鼠血糖与肾功能的影响。
3．3 糖尿病肾病大鼠肾组织病理改变。
正常组大鼠肾小球均无明显异常。模型组大鼠肾小球系膜细胞(MC)局灶性增生，呈分叶状，PAS阳性的均质蛋白性物质明显增多，肾小球系膜区细胞外基质(ECM)增
多，肾小球基底膜(GBM)增厚，肾间质中炎性细胞浸润，部分毛细血管受压而塌陷，且部分肾间质呈现钙化。各治疗组的肾小球结构也有类似的病理改变，但较模型组明显减轻，肾小球ECM增多及系膜细胞(MC)增生较DN组明显减轻，系膜区PAS阳性物质明显减少，绝大部分毛细血管腔处于开放状态，未发现肾间质钙化现象，B组与D组情况相似。
3．4 绞股蓝总甙片对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF－β1表达的影响。
3．5 绞股蓝总苷片对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF－β1mRNA表达的影响。
4 讨 论
DN病因及发病机制十分复杂，目前认为其发生和发展是由于糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、高血压、血流动力学异常、细胞因子分泌异常、反应氧中间产物和遗传因素等综合作用的结果。糖尿病肾病的基本病理特征是肾脏肥大，以肾小球系膜区为主的ECM进行性积聚，GBM增厚，最终导致肾组织纤维化和肾小球硬化。
TGF－β1作为重要的致纤维化因子参与了DN的发生和发展，主要存在于肾小管上皮细胞和肾小球上，它主要是通过自分泌和旁分泌机制发挥其多功能的调节作用，其调控机制可能发生在基因转录及翻译后水平。研究证明，TGF－β1除了介导高血糖所引起的病理效应之外，同时也介导了血流动力学、非酶糖基化、血管紧张素及内皮素等途径的病理生理改变。Akahori等发现，体外高糖培养的肾近曲小管间质细胞和系膜细胞均有TGF－β1mRNA表达及生物学活性增加。高糖及其糖化产物可激活PKC，导致TGF－β1的表达升高，造成肾的持续损害；也有人认为高糖也可能通过增加AngⅡ局部效应，继而通过PKC途径而上调TGF－β1的表达。TGF－β1能促进细胞的蛋白合成，阻止细胞从G1期过渡到S期，从而促进细胞肥大。Bordcr等发现，TGF－β1。可直接刺激肾小球系膜细胞增殖并表达多种系膜外基质成分。Tamaki等发现，TGF－β1通过刺激ECM中纤粘连蛋白(FN)、胶原等多种成分合成，减少蛋白酶表达和增加蛋白酶抑制合成，上调ECM受体整合素的表达，促进细胞与间质黏附及基质沉积等机制参与ECM进行性积聚过程。Singh等发现，TGF－β1通过上调蛋白酶抑制因子如金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)的合成，下调基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶(MMP)的合成，阻止新合成的细胞外基质降解。TGF－β1不但可以促使肾脏固有细胞肥大、细胞外基质(ECM)沉积，最终造成肾小球硬化和间质纤维化，还可以上调系膜细胞葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的表达，促进细胞对葡萄糖的摄入，引起细胞内糖代谢紊乱，导致ECM合成增加，因而抑制它的过度表达和作用可使肾脏病理和功能都得到改善。因此，有人认为TGF－β1过度形成或活性增高是DM患者肾性肥大及ECM积聚的最终的共同调节因子，且TGFβ1可能为DN发病机制的最后共同通路。
DN早期及时有效的治疗，可阻止肾脏病理改变进一步发展，一旦进入DN期，肾功能下降，则失去良好的治疗时机。目前现代医学在防治DN方面除强调控制血糖、血压等基础治疗外，尚元特效措施。近年来，随着对传统中医学的不断深入，如何应用中医中药延缓其病程进展已引起广大学者的关注。DN中医称为消渴病肾病，古人已认识到消渴病日久可累及肾，出现水肿、肿胀、尿浊、吐逆等症与糖尿病肾病的临床表现十分相似，初发时以阴虚燥热为主，渐转为气阴两虚或阴阳两虚，兼夹瘀、夹湿、夹浊毒的“本虚标实”之证。宋述菊等认为，脾虚是DN的关键．肾虚为DN的易感因素，痰瘀肾络，凝滞脉道是DN的主要病理变化，并贯穿于DN的整个病程。绞股蓝系葫芦科多年生落叶草质藤本植物，早在我国《救荒本草》中已有记载。绞股蓝具有养心健脾，益气活血，除痰化瘀的功效，与消渴肾病的肾虚痰瘀病机特点极为吻合。现代药理证明绞股蓝的主要药效成分为绞股蓝皂苷，其含有与人参皂苷Rbl、Rb2、砣、Rd结构完全相同的皂苷成份，具有抗高血脂、抗动脉粥样硬化、降低血糖、抗血栓形成、抗衰老、抗肿瘤、调节免疫功能、镇静、清除氧自由基、扩张外周血管、增加脏器的血流量等药理作用。孙万森等研究发现，绞股蓝皂苷能降低慢性肾功能衰竭患者的血脂，升高血红蛋白，改善肾功能及保护肾脏。张永等研究表明，绞股蓝皂苷具有抗梗阻性肾病大鼠肾纤维化的作用。总之，绞股蓝总皂苷可显著改善肾脏疾病患者的脂质代谢、蛋白质代谢，特别对治疗慢性肾脏疾病，在延缓肾衰竭进展方面具有重要意义。但是，对于绞股蓝总皂苷作用是否通过影响TGF－β1涉及糖尿病肾病，目前国内外尚缺乏相关研究。
本研究结果显示，各治疗组(A、B、C、D组)大鼠的一般情况、血糖及肾功能情况均明显优于模型组(E组)大鼠，与以往文献报道基本一致。肾脏病理组织学检查显示，治疗组较之模型组明显改善，肾小球ECM增多及系膜细胞增生较DN组明显减轻，系膜区PAS阳性物质明显减少，绝大部分毛细血管腔处于开放状态，未发现肾间质钙化现象。本研究从基因转录及翻译后表达两个角度，采用RT－PCR及免疫组化的两种方法较为先进的研究方法，从TGF－β1入手，分析绞股蓝皂苷对早期糖尿病肾病的治疗机制，免疫组化结果显示，正常对照组(F组)TGF－β1免疫组化染色较弱，表达较少，模型组染色从强度到面积都明显增加，表达增多，各治疗组表达介于正常对照组及模型组组间，其中D组与B组的表达接近；RT－PCR结果显示，各治疗组TGF－β1mRNA的表达较模型组降低，D组对TGF－β1mRNA的降低作用与B组相似。表明绞股蓝总甙片能够减轻实验性DN大鼠肾脏的病理改变，对DN大鼠的肾脏结构具有一定的保护作用，能明显抑制实验性DN大鼠TGF－β1过度表达，从而减少肾小球系膜区ECM的积聚，保护肾脏功能，延缓病程的进展。