中波紫外线对人血小板线粒体DNA影响的初步观察

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇中波紫外线对人血小板线粒体DNA影响的初步观察范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[摘要]目的：观察中波紫外线对人血小板线粒体活性及线粒体dna的影响，探讨其作为评测光损伤敏感系统的可行性。方法：以不同能量的中波紫外线照射人血小板，观察血小板线粒体活性及线粒体DNA光化产物环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）含量的变化。结果：接受不同能量中波紫外线照射的血小板，线粒体活性明显降低（P

[关键词]中波紫外线；人；血小板；线粒体DNA；环丁烷嘧啶二聚体

[中图分类号]Q591.3 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）05-0756-03

The efficacy of ultroviolet B irradiation to mitochondria DNA of human platelets

HUANG Mao-fang1,3,LIU Zhong-rong2,YANG Hui-lan2,ZHANG Ling1,2,XUE Li-zhang2,ZHANG Fa-zhou2

(1.Graduate Institute of Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China;2.Department of Dermatology,the General Hospital of Guangzhou Military Command;3.Guangzhou Dermatitis Preventive Institute）

Abstract: Objective To investigate whether human platelets could be applied on photoaging research. Methods After human platelets were irradiated with different doses of ultroviolet B, changes of mitochondria activity and cyclobutane pyrimidine dimmers（CPDs）in mitochondria DNA were observed. Results Change of mitochondria activity had significant difference(P

Key words:ultroviolet B;human; platelet; Mitochondria DNA; activity;cyclobutane pyrimidine dimmers

血小板是巨核细胞的衍生物，成熟的血小板内无细胞核而含有线粒体及线粒体DNA（mtDNA）[1]。线粒体内缺乏DNA损伤修复的酶系统，并且进行复制时所需要的DNA聚合酶是由核DNA编码的，因此一旦没有细胞核的血小板的mtDNA受损，损伤所致的mtDNA损伤可以很好的保留下来[2]。根据这一特点，我们认为mtDNA很可能可以作为体外评价紫外线光损伤作用的敏感系统。本实验以人血小板为研究对象，发现中波紫外线照射下血小板线粒体活性及线粒体DNA出现了变化。

1 材料和方法

1.1 材料：新鲜血小板由广州总医院输血科提供，来源于经常规检测为正常的健康志愿者献血的机采样本9份。

1.2 实验试剂与仪器：动物线粒体提取试剂盒（GENMED公司），Mito-Tracker Green线粒体绿色荧光探针（碧云天生物技术研究所），5% 牛血清蛋白（Sigma），环丁烷嘧啶二聚体单克隆抗体（sigma公司），兔抗小鼠－HRP标记抗体（SouthernBiotech）。日光模拟器（上海希格玛高科技有限公司，UV-100），超级酶标仪（Bio Rad，MXLEL 680），荧光显微镜（Leica，DMI6000B）。

1.3实验方法：收集新鲜血小板30～40ml。以PBS溶液稀释新鲜血小板至5×1011/L，分成实验组与对照组，其中实验组按2ml/孔置于24孔板，以日光模拟器发射的UVB作为光源照射1min，对照组不经照射处理。本实验观察在不同能量作用下，照射前后血小板线粒体活性及线粒体DNA的变化。

1.4 检测方法

1.4.1 中波紫外线照射剂量：以当日所测的UVB能量进行照射，实验使用的中波紫外线能量见表1。照射时间为1min。

1.4.2 血小板线粒体活性的测定[3]：用动物血小板线粒体粗提分离试剂盒，参照说明书上的方法进行血小板线粒体分离与提取。按Mito-Tracker Green绿色荧光探针说明书步骤进行线粒体活性检测：以无水DMSO74.4μl溶解Mito-Tracker Green至终浓度为1mM。然后用无血清细胞培养基（1640）稀释7000倍（即10ml 培养基加入1.5μl Mito-Tracker Green作为染色工作液，37℃避光预温。向提取出的血小板线粒体加入200μl的工作液。37℃孵育20min。去除Mito-Tracker Green染色工作液，等体积加入预温的新鲜细胞培养液。荧光显微镜观察，其中激发光波长为490nm, 发射波长为516nm，反复测3次，读取数据。

1.4.3 血小板线粒体DNA环丁烷嘧啶二聚体的测定[4]：照射后1h以动物血小板线粒体粗提分离试剂盒提取血小板线粒体DNA，在OD 260nm 检测分光光度吸收值测血小板线粒体DNA样品的浓度，将样品置沸水浴10min使其变性，然后冰浴快速冷却，用PBS溶液稀释到终浓度为2μg/ml。取溶液50μl加入到96孔聚苯乙烯板，干燥后以ELISA方法在酶联免疫阅读仪上读取OD490nm的数据。

1.5 统计学处理：应用SPSS12.0进行统计学分析，各组数据均以均数±标准差（x±s）表示，计量资料采用配对t检验，多个均数之间的差别比较用单因素方差分析，比较数据之间的相关性采用spearman相关性分析，以P

2 结果

2.1 血小板线粒体功能的测定结果：线粒体染色的荧光值见表2，对应的荧光值均数图见图1。

其中，样本A-H表示对应表1照射的光孔顺序，样本0为对照组。对结果进行单因素方差分析显示，F=4455，P

2.2 血小板线粒体DNA环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）的测定结果 线粒体DNA在490nm的OD值见表3，对应的OD值均数图见图2。

其中，样本A-H表示对应表1照射的光孔顺序，样本0为对照组。对结果进行单因素方差分析显示，F=345.5，P0.05，没有统计学差异。其余各组之间P

3 讨论

皮肤光老化是在日光照射条件下长期作用的结果。虽然紫外线照射可直接损伤皮肤组织细胞的DNA，但细胞核DNA有酶修复系统，一过性的轻微损伤可能经过修复而无法检测，因此，光老化的研究中，寻找能保留光损伤的敏感载体非常有必要。

线粒体是人体细胞中除细胞核外唯一具有自身遗传物质（如DNA）的细胞器。其主要功能是通过呼吸链(电子传递链和氧化磷酸化系统)为细胞活动提供能量，并参与一些重要的代谢通路[5]。线粒体DNA的特点是缺乏组蛋白的保护并且没有完整的突变修复功能，因此mtDNA的突变率远高于核DNA突变[6]，这些特点使线粒体对损伤的反应非常敏感，线粒体DNA突变及累积被认为是人类皮肤老化尤其是皮肤光老化的重要因素[2]。而研究线粒体DNA的变化需要排除核DNA的影响，这是我们选择用不含核DNA的血小板作为体外实验对象的原因。

光老化线粒体的损伤可表现为线粒体膜电位的降低，过氧化产物的增加，ATP合成的减少等[7]。从整体上而言，都是线粒体活性降低的表现之一。我们以对皮肤的损伤强度比UVA大约800～1000倍的中波紫外线（UVB）[8]照射血小板，从整体上观察照射前后血小板线粒体活性，以及mtDNA光损伤产物CPDs的变化，作为研究体外评价紫外线光损伤作用的参考指标。

实验中所用的Mito-Tracker Green绿色荧光探针，可特异性被线粒体以不依赖膜电位的形式摄取，线粒体活性好，则摄取的探针多，则显现的荧光亮且均匀。通过观察线粒体摄取能力的变化，可作为评价线粒体活性的一个指标。本实验以不同能量的UVB照射血小板达1min，线粒体活性出现了具有统计学差异的变化，而且UVB照射的剂量不同，荧光值也随之波动：UVB能量越大，线粒体摄取的探针越少，荧光值则越低。这说明，UVB照射能影响血小板线粒体的活性，而且这个改变比较灵敏，随照射剂量的不同而改变，有利于实验室条件下光损伤的研究。

UVB照射皮肤细胞可直接引起DNA损伤，核酸DNA的芳香族杂环碱基对是UVB的强吸收色基。在UVB照射下，同条DNA链上相邻的嘧啶碱基形成聚和体，即光产物，包括环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）、6-4光产物（6-4PPs）及其异构体。有核细胞DNA在损伤后可进行自我修复，约90% 6-4PP在照射后3h即被修复[9]，而CPDs的碱基易突变，形成量大(占70%～80%)，是6-4PPs的3倍，故常认为CPDs是细胞光损伤的主要产物[10]。在血小板线粒体中，DNA没有酶修复系统，这些光损伤比表皮细胞更容易保留。我们观察到不同剂量的UVB照射下，血小板线粒体DNA光损伤产物CPDs的含量随之变化，同时还有与剂量相关的平台期，说明UVB照射能直接损伤血小板线粒体DNA，而且这个改变容易保留下来被检测到，并且这个改变与照射剂量的有相关性，有利于实验室条件下从DNA角度对光老化进行研究。

在不同剂量的UVB照射下，我们观察到血小板不仅有线粒体活性的损伤，同时合并有线粒体DNA光损伤产物的变化，而且，这些变化程度都与照射的剂量有相关性，随着照射剂量的增加，线粒体DNA的损伤在不断加重，活性不断降低。这表明，把血小板作为作为体外评价紫外线光损伤作用的敏感系统是可行的。如果能建立体外评价光损伤的细胞系统，将有利于体外进行光损伤相关机制的研究及抗光损伤药物的筛选等。

[参考文献]

[1]鲍幼玲,黄耀熊,蒋鸿雁,等.微波辐射对血小板线粒体基因的影响[J].中国医学物理学杂志, 2007,24(2):137-139.

[2]刘仲荣,刘荣卿,张国威,等.PUVA诱导皮肤mtDNA4977bp缺失突变累积的研究[J].临床皮肤科杂志,2002,31(12):743-745.

[3]黄茂芳,刘仲荣,杨慧兰,等.中波紫外线对人血小板线粒体活性影响的初步观察[J].皮肤性病诊疗学杂志,2011,18(2):73-75.

[4]林向飞,骆 丹,闵 玮,等. UVB 辐射后HaCaT 细胞光产物的产生和清除及 EGCG 的干预作用[J]. 中国美容医学,2006,15(4):384-386.

[5]DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial respiratory-chain diseases[J].N Engl J Med, 2003, 348: 2656?2668.

[6]王学波,李建远.人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立[J].生物医学工程研究，2008,27(4):298-301.

[7]黄发军，曾凡慧. 衰老过程中线粒体的改变[J]. 湖北民族学院学报（医学版）,2009,26（2）：80-83.

[8]Nghiem DX, Kazimi G.Clydesdale,et al. Ultraviolet A radiation suppresses an established immune response: Implications for sunscreen design[J].J Invest Dermatol,2001,117:1193-1199.

[9]Xu G,Snellman E,Jansen CT,Hemminki K. Levels and repair of cyclobutane pyrimidine dimers and 6-4 photoproducts in skin of sporadic basal cell carcinoma patients [J]. J Invest Dermatol,2000,115(1):95-99.

[10]You YH,Lee DH,Yoon JH,et al. Cyelobutane Pyrimidine dimmers are responsible for the vast majority of mutations induced by UVB irradiation in mammalian cells[J].Biol Chem,2001,276:44688-44694.

[收稿日期]2012-01-10 [修回日期]2012-03-09