杀虫安对小鼠脑内氨基酸含量的影响
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇杀虫安对小鼠脑内氨基酸含量的影响范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：目的：研究杀虫安对小鼠脑内氨基酸含量的影响。方法：IcR小鼠30X，随机分为空白对照组、杀虫安低剂量组(200mg・kg-1)和杀虫安高剂量组(300 mg・kg-1)，小鼠灌胃后出现惊厥时断头取脑，采用液相色谱质谱法测定脑内氨基酸的含量。结果：与对照组相比，杀虫安低剂量组和高剂量组脑内氨基酸含量具有显著性差异。脑内天门冬氨酸和谷氨酸含量升高(P
关键词：杀虫安；兴奋性氨基酸；抑制性氨基酸；液相色谱质谱法
中图分类号：R996.3 文献标识码：A 文章编号：1674－0432(2011)－05－0092－2
杀虫安(Profurite aminium)化学名称为2(N，N－二甲胺基)－1，3双硫代酸铵基丙烷，是一种广谱长效高活性的沙蚕毒素新型农药，主要用于防治水稻、蔬菜、柑橘、甘蔗等作物的水稻螟虫、稻纵卷叶螟、甘橘潜叶蛾、菜青虫、蚜虫等多种害虫，具有触杀、胃毒及内吸作用。杀虫安急性中毒时，除引起瞳孔缩小、肌肉松驰和呼吸抑制等症状，还经常出现肌束震颤、翘尾、抽搐等中枢兴奋症状。本实验采用杀虫安给小鼠灌胃，观察小鼠脑内氨基酸递质的变化，以期探索杀虫安导致中枢毒性的机制。
1 材料和方法
1.1药品、试剂和仪器
杀虫安，宁波舜宏化工有限公司提供，含量93％；标准品：甘氨酸(Glγ)、天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)均购于美国sigma公司；高氯酸(分析纯，上海金鹿化工有限公司，20090516)；甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司，0611 19101)；乙腈(色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司，061208101)；其他试剂均为分析纯，实验用水均为重蒸水(本实验室自制)。3200－TRAP LcMs／Ms(美国Applied Biosγstems公司)；D－37520高速冷冻离心机(德国Osterode公司)；Jγ92－2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技有限公司)。
1.2脑内氨基酸递质的测定
1.2.1动物分组及给药ICR小白鼠30只(20±2)g，雌雄各半，由温州医学院实验动物中心提供。随机分成对照组、杀虫安低剂量组和杀虫安高剂量组，每组10只，灌胃给药。低剂量组给予杀虫安200mg・kg-1，高剂量组给予杀虫安300mg・kg-1，对照组给予等容量的生理盐水灌胃。给药后待小鼠出现惊厥时处死，断头取脑组织待测。
1.2.2脑组织样品处理方法取小白鼠全脑，滤纸吸干后，称重。以体积比1：2的比例加入50％的甲醇溶液，在超声细胞粉碎机内制备匀浆液，4℃以下，18000r／min，离心15min，取上清液。上清液稀释10倍，取10μL稀释液，加入100μL同位素内标，涡流混匀2min，15000rpm离心5min，50℃水浴条件下氮气流吹干。加60μL盐酸正丁醇，涡流混匀，15000rpm离,b5min，在65℃下柱前衍生15min，50℃水浴条件下氮气流吹干。用100μLZ,腈：水(8：2)混合液复溶，涡流混匀，15000rpm离,&5min，将上清液放入自动进样器的样品瓶中，设定5μL进样，用LC－MS／MS检测。
1.2.3色谱条件色谱柱为ZORBAX Eclipse AAA C18(4.6min×150mm，5μm，Agilent，USA)；流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱；流速：1.0ml／min；柱温：50℃；进样量：5μL。
1.2.4质谱条件离子源：电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测(MRM)扫描方式；电喷雾电压(Is)：3500V；离子源温度(TEM)：570℃；辅助气1压力(Gsl)：55kPa，辅助气2压力(Gs2)：66kPa；气帘气压力(cuR)：20kPa；碰撞气(cAD)：Medium；入口电压(EP)：10V，出口电压(CXP)：2V。
1.2.5标准曲线的制备与样品分析以各氨基酸与相对应同位素内标的峰面积比值(Ai／As)为纵坐标，以所对应各点浓度(c)为横坐标绘制标准曲线。天门冬氨酸的标准曲线回归方程为γ=3.01×10-5x+0.00969(r＝0.9953)，在100 5000mg・mL-1之间呈良好的线性关系；谷氨酸的标准曲线回归方程为γ 3.49×104x+0.0852(r＝0.9948)，在500 50000mg・mL-1之间呈良好的线性关系；甘氨酸的标准曲线回归方程为γ=9.96×10-5x+0.0148(r=0.9942)，在100－5000mg・mL-1之间呈良好的线性关系；γ－氨基丁酸的标准曲线回归方程为γ＝4.93×10-5x+0.000783(r=0.9954)，在100-1000mg・mL-1之间呈良好的线性关系。将测定的样品峰面积代入相应的标准曲线方程，计算出每种递质的含量，乘以稀释倍数，并除以脑组织湿重，所得值为每克组织中各物质的含量(μg・g1)。
1.3统计学处理
数据用X±S表示，用SPSS17.0软件进行统计分析，组间比较按方差分析进行统计处理。
2 结果
2.1杀虫安灌胃后动物表现
ICR小鼠用杀虫安灌胃后均出现惊厥症状，主要表现为全身肌束震颤，竖毛、翘尾、蹦跳、抽搐等症状。低剂量组出现惊厥时间为10min左右，高剂量组出现惊厥时间有所提前，大约7min左右，对照组给药后无明显反应。
2.2氨基酸神经递质的色谱行为
氨基酸的标准品以及动物脑组织样品，经LC MS／Ms检测分析得到的总粒子流图见图1。由图可见在本实验条件下，甘氨酸、牛磺酸、γ－氨基丁酸、谷氨酸和天门冬氨酸能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰。甘氨酸的保留时间为2.83min，牛磺酸的保留时间为4.54min，γ－氨基丁酸的保留时间为5.45min，谷氨酸的保留时间为9.71min，天门冬氨酸的保留时间为10.72min。
A：标准品；B：空白对照组：C：低剂量杀虫安组；D：高剂量杀虫安组；Glγ：甘氨酸；GABA：γ－氨基丁酸；Glu：谷氨酸；Asp：天门冬氨酸。
2.3脑组织样品中氨基酸递质的测定
小鼠杀虫安灌胃后脑内氨基酸递质含量的测定结果见表1。由表可见，杀虫安灌胃后引起惊厥时脑内兴奋性氨基酸天门冬氨酸和谷氨酸有明显升高，而抑制性氨基酸甘氨酸和γ－氨基丁酸则出现下降，与空白对照组比较均具有显著性差异。低剂量组与高剂量组之间只有γ氨基丁酸的含量具有显著性差异，其他氨基酸含量无显著性差异。
3 讨论
本研究采用液相色谱质谱法检测脑组织中氨基酸含量，此方法专属性高，分离完全，灵敏度高，可满足小鼠脑组织中氨基酸的测定。检测氨基酸时，因为0.1mol・L-1的高氯酸可能会影响氨基酸的稳定性，所以选择甲醇溶液来处理待测氨基酸的脑组织。
杀虫安属于沙蚕毒素农药，采用杀虫安大剂量灌胃时会产生明显的惊厥症状终至呼吸衰竭而死亡，显示大剂量杀虫安灌胃致死是由于中枢兴奋所致。但杀虫安引起中枢毒性的机制还鲜有研究，本实验对此进行了初步的探索。
惊厥是中枢兴奋的症状之一，也是中枢神经系统紊乱的一种表现，惊厥与脑内氨基酸异常有关，脑内抑制性氨基酸GABA、Glγ含量下降，兴奋性氨基酸Glu、Asp含量升高，脑内兴奋性和抑制性氨基酸失衡均可导致惊厥。本实验表明，杀虫安引起惊厥时不仅降低脑内GABA，同时也使脑内Glu含量升高，使Glu／GABA高于正常动物的水平。实验显示高剂量组与低剂量组之间GABA水平存在显著性差异，是否可以推断杀虫安引起中枢兴奋更主要是影响了抑制性氨基酸水平，或者杀虫安抑制了谷氨酸脱羧酶的活性，这还需要进一步研究证实。
杀虫安所致的中枢兴奋与兴奋性氨基酸、抑制性氨基酸和单胺递质等多种递质均有关系，但是何种机制发挥主要作用，机制之间、递质之间存在怎样的联系尚需进一步研究。
参考文献
[1]刘乾开，朱国念.新编农药使用手册[M].上海：上海科学技术出版社，1999，120－121
[2]陈醒言，林丹，胡国新.舒筋灵，唛酚生，地西泮对杀虫单中毒的保护作用[J].温州医学院学报，2000，30(3)：188－189