缺氧缺血性脑损伤新生猪海马皮层琥珀酸脱氢酶活性变化
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇缺氧缺血性脑损伤新生猪海马皮层琥珀酸脱氢酶活性变化范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【中图分类号】R364.4【文献标识码】A【文章编号】1005-2720(2009)05-0137-03
【摘要】目的：研究缺氧缺血性脑损伤新生猪海马皮层琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的变化，以了解能量代谢在缺氧缺血性脑损伤作用。方法：60只3d小猪随机分成对照组(行假手术并放置于自然空气中)和实验组，实验组结扎颈总动脉后放于8%氧气、92%氮气中2h，制成HIBD模型，然后置于自然空气中。根据在自然空气中放置的时间分为5组(0h组、24h组、48h组、72h组、96h组)。每组10只，每只小猪采集左侧海马皮层后提取线粒体，测定其SDH活性。结果：对照组与0hr组SDH活性分别为(18.00±0.47)μmol/(min・mg)和(17.94±0.67)μmol/(min・mg)蛋白，二者无显著性差异(P>0.05)。SDH活性于24h下降至最低，为(9.16±0.59)μmol/(min・mg)蛋白，明显低于对照组及0h组(P0.05)。结论：研究显示新生动物在缺氧缺血期脑线粒体SDH活性较对照组无显著差异，再灌注时发生明显变化。这是线粒体能量代谢障碍的直接原因之一，也支持在HIBD中线粒体对神经元凋亡起关键性的作用，为早期寻找干预缺氧缺血引起的线粒体及相继细胞损伤的“治疗时间窗”提供理论基础。
【关键词】脑缺氧；脑缺血；线粒体；呼吸链复合物；琥珀酸脱氢酶
Succinate dehydrogenase activity in hippocampal cortex of neonatal pigs after hypoxic-ischemic brain damage.Du Lijun，Tang Hongmei，Li Weiru，et al.(1The department of pediatrics，the fifth people’s hospital of Chengdu，Sichuan 611130 China；2the second Huaxi hospital of Sichuan university)
【Abstract】Objective：To study the succinate dehydrogenase(SDH) activity in hippocampal cortex of neonatal pigs after brain damage with hypoxic-ischemia and refusion，so as to understand the value of energy metabolism in HIBD.Methods：Sixty pigs of three days old were randomly assigned to five experimental groups and a control group.The experimental groups were performed cerebral hypoxic-ischemia by ligating left common carotid artery and then exposed to 8% O2 and 92%N2 to establish the HIBD animal model.According to the normoxic-atmosphere exposing time，the experiment groups were divided into five groups (0h，24h，48h，72h，96h).Sham operations were performed on the control group which were exposed to normal atmosphere during the experiment period.Mitochondria of left hippocampal cortex were isolated from each pig，and the SDH activity was examined by spectrophotometer.Results：The SDH activity of 0h group was the same as that of control group.The number was (17.94±0.67)μmol/(min・mg) protein.The SDH activity of 24h declined the lowest point.It was (9.16±0.59)μmol/(min・mg) protein.And it was lower than 0h and control groups’ obviously.At 48h，the SDH activity began to restore，and reached the level of the control group in 96h group.Conclusion：There are no significant differences of the mitochondrial SDH activity in the newborn hypoxic ischemic period between study group and cintrol group，and the SDH activity changes in reperfision time.This directly caus the barriers of mitochondrial energe metabolism，and support the crucial role in the mitochondrial in neuronal apoptosis in HIBD，and provide the theorotcal basis to look for the “therapectic window”of the early intevention with hypoxic ischemic caused by mitochondrial damage and cells damage.
【Key Words】Cerebral hypoxia；Cerebral ischemia；Mitochindrial respiratory chain complex；Succinate dehydrogenase
新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是缺氧的严重并发症，也是围生期窒息死亡的重要原因之一。近年来对于HIE的发病机制及相应的干预措施一直倍受关注，如再灌注损伤和氧自由基、钙超载、兴奋性氨基酸、细胞因子、神经细胞凋亡等发病机制的研究。虽然线粒体能量代谢障碍在成人脑病发生中的重要作用已经肯定，但对新生儿脑损伤时线粒体的变化相关研究较少。线粒体内膜上的呼吸链酶组分参与氧化磷酸化过程，缺氧缺血后线粒体损伤已被肯定。线粒体损伤后出现线粒体肿胀、嵴溶解、断裂、消失和膜脂质分解增加[1]，ATP生成减少[2]，呼吸调控丧失[3，4]。有实验表明，缺血再灌注30min后出现神经元肿胀、线粒体损伤等病理变化；再灌注2h后，病理改变更明显。本研究通过对新生猪缺氧缺血性脑损伤(HIBD)海马皮层琥珀酸脱氢酶活性的测定，以了解线粒体损伤在HIE的发病机制中的作用，为探求HIE时间治疗窗和相应的干预措施提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 研究对象：新生1~3d龄健康小猪60只，均为白猪，反应佳，进食好，外观无异常。同一窝小猪随机分成对照组、HIBD后0h组、24h组、48h组、72h组和96h组，每组各10只，各组小猪体重经统计学处理，无显著性差异(P>0.05)。
1.2 HIBD动物模型制作[6]：新生猪用1%普鲁卡因局部麻醉后，结扎左颈总动脉。术毕30~60min后将新生猪置容器中放置2h，即为新生猪动物模型。取出新生猪放入自然空气中，根据放入自然空气中的不同时间定为HIBD后0h、24h、48h、72h、96h五组，对照组行假手术，分离左侧颈总动脉，但不结扎。
1.3 脑海马皮层组织采集：以上各组猪于预定时间行断头术处死后，立即取出左侧大脑半球，迅速去其蛛网膜及血管，切取海马区皮层组织约1g，放入带有冰渣的脑分离介质的烧杯内备用。
1.4 线粒体的提取及蛋白定量
1.4.1 线粒体提取
1.4.1.1 用分离介质清洗脑组织3遍，剪碎，加脑分离介质5ml搅拌后装入25ml的匀浆器内，上下匀浆30~50次，制得脑组织匀浆。
1.4.1.2 脑组织匀浆分装于两个离心管内，2000r/min离心3min。
1.4.1.3 取上清液装入另两个离心管内，12500r/min离心8min，弃上清，留沉淀。
1.4.1.4 用3%Ficoll液0.5ml悬浮沉淀。此为粗制线粒体。
1.4.1.5 离心管内装入6%Ficoll液1ml，将上述3%Ficoll悬浮的粗制线粒体小心铺于此液上。11500r/min离心30min。
1.4.1.6 弃上清留沉淀，将覆盖于线粒体表面的蓬松物以吸管清除，加脑分离介质1ml，12500r/min离心10min。
1.4.1.7 弃去上清，加1ml脑分离介质，轻轻悬浮制备的线粒体，置于-70℃备用。
以上操作均使分离介质始终保持有冰渣状态。
1.4.2 蛋白定量：采用Bradford检测法。
1.4.2.1 标准曲线建立：用牛血清白蛋白配制成不同浓度的标准液0.2ml，再加入Bradford工作液2ml，用721分光光度计，波长595nm，测出不同的光密度(OD)值，用直线回归方法计算出回归方程，建立标准曲线。
1.4.2.2 蛋白含量测定：线粒体提取液40μl，用脑分离介质稀释5倍，加入2ml Bradford工作液，混匀后2min，用721分光光度计，波长595nm，测定光密度后，根据蛋白标准曲线计算蛋白含量。
1.5 SDH活性测定
1.5.1 原理：琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体，如与PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)，DCPIP(2，6-二氯酚靛酚)等发生反应，催化琥珀酸的氧化，而借助这些中间产物的颜色变化，通过分光光度计检测即可加以定量反映。其反应式如下：
①uccinate+PMSFumarate+PMSH2
②PMSH2+DCPIPPMS+DCPIPH2
DCPIP呈蓝色，标准的吸收光谱在600nm处，这种色泽可因其还原而渐次变淡，从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比。一分子DCPIP被还原，即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化，来计算SDH的活性。
1.5.2 方法
1.5.2.1 从-70℃冰箱中取出样本，轻摇冻溶3次。
1.5.2.2 对照管中加入：DCPIP 0.1ml，PMS 0.1ml，0.045M氰化钾0.1ml，0.27M琥珀酸0.1ml，0.2M pH7.6的磷酸盐2.6ml。
1.5.2.3 实验管中加入：DCPIP 0.1ml，PMS 0.1ml，0.045M氰化钾0.1ml，0.27M琥珀酸0.1ml，0.2M pH7.6磷酸盐(Na)缓冲液2.4ml，线粒体蛋白0.2ml。
1.5.2.4 标准管中加入：DCPIP 0.1ml，PMS 0.1ml，0.045M氰化钾0.1ml，0.27M琥珀酸0.1ml，0.2M pH7.6磷酸盐(Na)缓冲液2.6ml。
1.5.2.5 标准对照管中加入：0.2M pH7.6磷酸盐(Na)缓冲液3ml。
1.5.2.6 充分混匀，放于36℃水浴中15min，流水冷却，600nm波长比色。
1.5.2.7 SDH活性计算：(标准-测定)/标准×0.1mM×1/0.2÷15×1000μmol/L÷蛋白(mg/ml)=μmol/(min・mg)蛋白。
1.6 统计处理：各组间SDH活性比较采用方差分析，经F检验有显著性差异者，再做两两比较的q检验。
2 结果
2.1 缺氧缺血新生猪行为变化：HIBD组缺氧缺血10min即出现烦躁，活动增加，呼吸加深加快，30min出现嗜睡、呼吸不规则，暴露于正常空气中后24h出现明显神经系统受损症状，表现为嗜睡、肌张力低、拒食，24h有20%的新生猪出现惊厥，48~72h有表现为抽搐频繁，惊厥猪占此时段组的80%，该表现时相与HIE患儿相似。
2.2 不同时间组海马皮层SDH活性变化比较：见表1。
经统计学分析，对照组与0h组脑海马皮层SDH活性无差异(P>0.05)，24h组较对照组、0h组SDH活性明显下降，差异有显著性(P
3 讨论
新生儿缺氧缺血性脑病是因围产期宫内缺血缺氧影响胎儿脑细胞能量代谢，导致缺氧性脑病变，出生后出现一系列脑病症状。脑的能量来源几乎全靠血液供给葡萄糖和氧，新生儿期脑的代谢最旺盛，脑的氧耗量约占全身的一半，故围产期缺血缺氧首先影响脑的能量代谢。当缺氧时，脑内葡萄糖主要以糖酵解方式氧化供能，由于糖酵解产能极少，只有有氧氧化的1/19，为了提供足够的能量，葡萄糖的消耗必然大增，乳酸的生成也随之增多。当脑组织中葡萄糖的储备量耗尽，血液又不能供给葡萄糖时，脑就失去了能量供应，脑的正常生理活动立即受影响，如酶系统活性减低，细胞膜通透性发生改变，钠泵运转停止，膜电位不能维持，不能产生或传导神经冲动，神经细胞功能丧失。线粒体是细胞的动力工厂，与三羧酸循环、脂肪酸和丙酮酸氧化等有关的酶系均存在于线粒体基质中。线粒体内膜上的呼吸链酶组分参与氧化磷酸化过程。琥珀酸脱氢酶(SDH)是位于线粒体内膜和嵴上的呼吸酶，是琥珀酸呼吸链的起始酶。它是三羧酸循环的限速酶，其功能是从琥珀酸接受电子到FAD，经Fe-S中心传递到泛醌。
正常情况下，酶的活性是由酶的浓度、底物的浓度、pH值及激动剂和抑制剂所调节。同样，琥珀酸脱氢酶亦受以上因素调节。此外，Ca2+和钙调蛋白调节着酶的活性。游离Ca2+的穿膜流动调节着线粒体的脱氢酶。适当浓度的Ca2+和钙调蛋白促进琥珀酸脱氢酶的活性。缺氧缺血后，线粒体的结构和功能均受到损害，线粒体各种代谢酶活性异常变化，导致能量代谢耗竭，细胞凋亡。琥珀酸脱氢酶(SDH)功能的丧失意味着氧化磷酸化障碍[5]，它的损伤程度与线粒体损伤程度呈平行关系[6]。
SDH在缺血缺氧损伤后的改变与缺氧缺血及再灌注时有密切关系。目前认为，脑缺血后多数神经元的氧化性损伤发生于再灌注期而不在缺血/缺氧期[7]。有人研究发现[10]缺氧70min后心肌琥珀酸脱氢酶活性无显著变化，而再灌注后SDH活性显著降低。本研究显示在缺氧缺血再灌注即刻SDH活性与正常对照组间无明显变化(P>0.05)，与以上观点一致。
而在缺血再灌注期，发生瀑布效应产生大量的氧自由基[18]，并由此提出了脑损伤的自由基学说[9]。氧自由基可以通过膜的脂质过氧化反应损伤或杀死细胞。有实验表明，脑缺血及再灌注过程中，脑组织中脂质过氧化增强[10]。临床研究也发现，缺氧缺血性脑病患儿血中脂质过氧化物(LOP)增加。另一方面，SOD及GSH-px活性降低，清除氧自由基能力降低，加重线粒体损害，SDH活性下降，具体机制如下：破坏脂质细胞膜；破坏蛋白质和酶；破坏核酸和染色体。除氧自由基损害线粒体致SDH活性下降外，细胞内Ca2+超载是另一不可忽视的因素。研究表明[11]，线粒体Ca2+可激活SDH活性及代谢过程。缺氧缺血再灌注后，线粒体和胞浆内Ca2+超载，它是缺血性神经细胞损伤的重要因素。Ca2+在多个环节，多种代谢途径上的毒性作用，最终导致了细胞死亡，SDH活性降低由于以上多种原因的影响使SDH活性于缺血再灌注后明显下降(P
因而本研究发现再灌注48h组及72h组SDH活性逐渐恢复，有上升趋势，且随时间延长明显升高，该两组与24h组均有显著性差异(P均0.05)，与以上研究不完全一致。
有假说[12]认为：细胞变质过程可能在缺血期开始，紧接着才会启动引起神经元死亡的通道机制，缺血期后有一干预线粒体功能障碍和细胞损伤的“治疗时间窗”，本研究结果支持这一假说。本研究为HIE病人再灌注的超早期进行治疗，防止或减轻继发性损害，探索各种干预措施疗效提供了理论基础。
【参考文献】
[1] Nakahara I，Kikuchi H，Taki W，et al.Degradation of mitochondrial phospholipids during experimental cerebral ischimia in tats.J Neurichem，1991，57：839~844.
[2] Mergner WJ，Smith Mw，Trump BF.Studies in the pathogenesis of ischemic cell injury：XIP/O ratio and acceptor control.Virchowx Arch，1997，26：17~26.
[3] Schweiger H，Arnold E，Koch W，et al.Ischemia-induced alterations of mitochondrial structure and function in brain，liver and heart muscle of young and senescent rats.Biochem Med Metab Biol，1991，40：162~185.
[4] Hawkins R.Cerebral energy metabolism and metabolic encephalopathy.Plenum，New York，1985，PP：3~17.
[5] Yishino M，Kato K，Murakame K，et al.Shift of anaerobic to anaerobic metabolic in the rats acclimatized to p Biochem Physiol，1990，97：341.
[6] Mitchell MB，Meng XZ，Aol，et al.Preconditioning of isolated rat heart is mediated by protein kinase C.Circ Res，1982，239：57~69.
[7] Niles NR，et al.The value of histochemitry in the analysis of myocardial dysfunction.Lancet，1964，1：963.
[8] Phillis JW.A radical view of cerebral ischemic injury.Prog Neurobiol，1994，42：441~448.
[9] Chan PH.Role of oxidants in ischemic brain damage.Strike，1996，27：1124~1129.
[10] 张严龙，严徽瑾.大鼠全脑缺血再灌注后丙二醛及超氧化物歧化酶活性的变化.基础医学与临床，1992，12：32.
[11] Ezawa I，Ogata E.Ca2+-inducedactiration of succinate dehydrogenase and the regulation of mitochondrial oxidative reactions.J Biochem，1979，85：65~74.
[12] Almeida A，Allen KL，Bates TW，et al.Effect of reperfusion following cerebral ischimia on the activity of the mitochondrial respiratory chain in the gerbil brain.J Neurochem，1995，65：1698~1703.
[收稿 2009-01-14]