荧光光谱法研究磷钨杂多酸与牛血清白蛋白的相互作用

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[摘要] 目的 探究磷钨杂多酸与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用机制。 方法 利用UV-VIS吸收光谱与荧光光谱，研究磷钨杂多酸与BSA的猝灭类型与作用机制，结合同步荧光法考察磷钨杂多酸对BSA构象的影响。 结果 磷钨杂多酸对BSA的荧光猝灭为静态猝灭，其结合常数分别为6.54×103（298K）与3.67×103（310K），结合位点数n为1，与BSA相互作用方式为静电引力。同步荧光法测定结果显示，磷钨杂多酸与BSA发生了相互作用，但没有改变BSA的构象。 结论 本研究通过分析磷钨杂多酸与BSA之间的作用机制，为后续多酸药物的研发提供了理论依据。

[关键词] 磷钨杂多酸；牛血清白蛋白；荧光光谱；紫外光谱；同步荧光

[中图分类号] R284.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）10（b）-0062-03

多酸化合物是通过具有d0、d1构型的金属阳离子以氧阴离子为桥进行自由组装而形成的低聚化合物。按照所含无机含氧酸根离子的同种与否，可分为同多酸和杂多酸，其中杂多酸已被广泛应用在功能材料、催化、相转移等多个领域，近年来，杂多酸在抗艾滋病、抗肿瘤和抗病毒方面也取得了令人瞩目的成就[1]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）能与血浆中的内源性和外源性物质结合，起到转运和存储药物的作用，研究多酸化合物与白蛋白的相互作用，在分析化学、生物化学和医学领域都具有重要的理论研究与参考价值。曾有文献研究了磷钨酸与BSA的结合平衡[2]，为研究磷钨杂多酸与牛血清白蛋白的相互作用，本文比较了不同温度下磷钨杂多酸与BSA的相互作用，讨论了其作用机制，并采用同步荧光光谱法研究了磷钨酸对BSA构象的影响，以期为进一步研究多酸药物的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：UV-2100紫外分光光度计（Shimadzu，日本），F-5301PC型荧光分光光度计（Shimadzu，日本），pH计（赛多利斯，德国），恒温水浴锅（国华电器）。

试药：BSA，用Tris缓冲溶液（0.1 mol/L，pH=7.4，内含0.1 mol/L NaCl）制成含BSA 2.0×10-5 mol/L的储备液，置冰箱中5℃低温保存；磷钨酸（H4[PW12O40]，国药集团）制成浓度约为3.2×10-6 mol/L的储备液。除Tris为生化试剂外，其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 磷钨杂多酸与BSA作用的荧光光谱测定 移取3 ml 2.0×10-5 mol/L的BSA于一系列5 ml离心管中，用微量进样器分别加入0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0 μl 3.2×10-6 mol/L的磷钨酸溶液，混匀，静置30 min后，固定λex=280 nm，测定在220～550 nm波长范围内的发射光谱。

1.2.2 磷钨杂多酸与BSA作用的紫外吸收光谱测定 分别测定浓度为3.2×10-6 mol/L的磷钨杂多酸、BSA以及磷钨杂多酸与BSA混合溶液（比例为1∶1）的紫外吸收光谱。

1.2.3 磷钨杂多酸与BSA作用的同步荧光光谱测定 采用“1.2.1”所配制的溶液在温度为298K条件下静置30 min，固定发射与激发的波长差分别为Δλ=60 nm和Δλ=15 nm，扫描同步荧光光谱。

2 结果与讨论

2.1 猝灭类型的确定

2.1.1 BSA荧光光谱的变化 固定BSA的量，向其中加入磷钨酸溶液。随着浓度的增加，BSA的荧光强度逐渐降低，证明磷钨杂多酸和BSA之间存在相互作用，产生了猝灭现象（图1）。

2.1.2 温度对荧光猝灭的影响 药物分子对蛋白质的荧光猝灭可分为能量转移猝灭、静态猝灭与动态猝灭[3]。能量转移猝灭的结果，通常使受体的荧光光敏化增强，在实验中容易观察。因此需要区别的是动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭为荧光体处于激发态时与猝灭剂引起的猝灭，由分子扩散和碰撞引起。静态猝灭作用是指荧光体与猝灭剂之间借助分子间力，彼此结合形成不发光的复合物从而导致荧光体荧光强度减弱的现象。一般来说，动态猝灭过程应遵循Stern-Volmer方程式[4]：F0/F=1+KA[Q]=1+Kqτ0[Q]。其中，F和F0分别代表加入与不加入猝灭剂时体系的相对荧光强度；[Q]是猝灭剂的浓度；KA与Kq分别为动态猝灭常数与荧光猝灭速率常数；τ0是没有猝灭剂存在时，荧光物质的平均寿命（τ0约为10-8 s）。本实验分别测定了在298K和310K时磷钨杂多酸与BSA相互作用的荧光光谱。根据Stern-Volmer方程绘制不同温度下F0/F-1～[Q]图（图2），表1为不同温度下磷钨杂多酸与BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程及猝灭常数。动态猝灭主要依赖于扩散效应，温度升高导致扩散速度加快，KA将随着温度的升高而增大，而从图2和表1都可以看出，随着温度的升高，直线斜率逐渐减小，故磷钨杂多酸对BSA的猝灭过程不是动态猝灭，而是静态猝灭。

2.2 热力学参数的计算和作用类型的推断

猝灭剂和白蛋白相互作用力包括范德华力、氢键力、疏水作用力和静电力。因为温度对反应的结合常数影响比较小，所以当温度变化范围不大时可以近似认为反应焓变为一常数，因此，根据热力学方程可知：ln（K2/K1）=ΔH/R（1/T1-1/T2），ΔG=-RTlnK，ΔG=ΔH-TΔS。用表1中的KA值计算热力学焓变ΔH、熵变ΔS和自由能变ΔG，其结果见表2。由表2可知，ΔG

2.3 BSA紫外吸收光谱的变化

本研究分别测定了pH7.4的条件下，BSA的紫外吸收曲线及磷钨杂多酸与BSA等摩尔混合物与磷钨杂多酸的差谱。由图3可知，磷钨杂多酸与BSA等摩尔混合物与BSA的紫外吸收光谱未完全重合，证明磷钨杂多酸与BSA的猝灭机制为静态猝灭。

2.4 结合位点数的计算

假设一个BSA分子有n个相互独立的结合位点可与磷钨杂多酸结合，则根据logKA+nlog[Q]=log（F0/F-1）分别作不同温度下log（F0/F-1）～log[Q]的对数图（图4），根据斜率可求得298K和310K时BSA对磷钨杂多酸的结合位点数分别为1.0和1.2，从而推测磷钨杂多酸与牛血清蛋白二者均为1∶1结合[6]。

2.5 结合常数的计算

对于1∶1结合的静态猝灭，磷钨杂多酸与BSA的结合常数可以根据Lineweaver-Burk方程求得：（F0-F）-1=F0-1+（KLBF0）-1[Q]-1。根据此方程，以（F0-F）-1对[Q]-1作图，可以求得不同温度下的KLB（表1）。

2.6 猝灭机制的确定

通过温度对猝灭的影响和BSA紫外吸收光谱的变化这两种方法的综合考察，可以确定，磷钨杂多酸与BSA相互作用的机制主要为静态猝灭。

2.7 BSA同步荧光光谱的测定

保持Δλ=60 nm，作BSA的同步荧光光谱，此时同步荧光光谱仅表现出色氨酸的荧光。保持Δλ=15 nm，作BSA的同步荧光光谱，此时同步荧光光谱仅表现出酪氨酸的荧光[7]。固定BSA的量，逐渐增加磷钨杂多酸的加入量，两者的荧光强度均下降，而色氨酸的下降幅度更大，说明磷钨杂多酸与BSA的结合位点更接近于色氨酸。两者的最大发射波长没有明显变化，证明磷钨杂多酸与BSA发生了相互作用，但是并没有改变蛋白的构象。

3 小结

本文研究了磷钨杂多酸与BSA之间的作用机制，结合温度对荧光猝灭的影响与BSA紫外吸收光谱的变化，确定磷钨杂多酸与BSA相互作用的机制主要为静态猝灭。通过BSA同步荧光光谱的测定，证明磷钨杂多酸与BSA发生了相互作用，但是并没有改变蛋白的构象，为后续多酸药物的研发提了供理论依据。

[参考文献]

[1] 刘霞，熊宇迪.多酸药物化学研究进展[J].中国现代应用药学杂志，2007，24（4）：282-285.

[2] 黄瑾，袁余洲，梁宏.紫外光谱、荧光光谱及平衡透析研究磷钨杂多酸与HAS或BSA的结合平衡[J].中国科学·B辑，2001，31（6）：530-535.

[3] 陈国珍，黄贤智，郑朱梓，等.荧光分析法[M].2版.北京：科学出版社，1990.

[4] 王彦卿，张红梅，张根成.硅钨杂多酸与牛血红蛋白相互作用研究[J].无机化学学报，2006，22（6）：895-899.

[5] 沈卫阳，钟绍鹏，陈建秋.荧光光谱法研究硅钨酸及硅钨钴杂多酸与牛血清白蛋白的相互作用[J].中国药科大学学报，2011，42（2）：131-135.

[6] 梁彦秋，邓斌，梁婷婷，等.杂多酸盐K7[PTi2W10O40]·6H2O与牛血清白蛋白相互作用的研究[J].无机化学学报，2007，25（4）：688-692.

[7] 周能，梁逸曾，王平，等.荷花碱与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析化学，2008，36（8）：1066-1070.

（收稿日期：2013-06-04 本文编辑：袁 成）