茅莓黄酮体外抗氧化活性研究

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摘要：为了研究茅莓（Rubus parvifolius L.）不同部位（根、茎、叶）中总黄酮的体外抗氧化活性，试验分别考察了茅莓根、茎、叶中总黄酮对羟自由基（·OH）、超氧负离子（O2-）、有机自由基（DPPH·）的清除能力及对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化反应产物丙二醛（MDA）的抑制率。结果表明，茅莓各部位黄酮在一定浓度范围内，其清除羟自由基（·OH）、超氧负离子（O2-）、有机自由基（DPPH·）及抑制MDA的作用均呈量效关系。说明茅莓根、茎、叶中总黄酮均具有一定的体外抗氧化活性。

关键词：茅莓（Rubus parvifolius L.）；总黄酮；抗氧化活性

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5828-04

茅莓（Rubus parvifolius L.）又名红梅消、天青地白草等，系蔷薇科悬钩子属植物茅莓（Rubus parvifolius L.）的干燥全草。本品为民间常用草药，落叶小灌木，生于山坡、路旁荒地、灌丛和草丛中，适应性强，资源十分丰富，分布于河北、山西、陕西、四川以及中南和华东各省[1]。茅莓根、茎、叶均可作药用，具有清热凉血、止血、散结止痛、利尿消肿等功效[2]，其化学成分有皂苷[3，4]、黄酮[5]、酚酸类物质[6]、萜类[7]以及挥发油[8]等多种成分。研究发现茅莓根、茎、叶中均含有黄酮类物质，黄酮类化合物具有良好的抗氧化性能，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老和增加机体免疫力、降血压、降血脂、增进冠状动脉血流量、软化血管和防治冠心病、心绞痛及抗肿瘤等功能[8-11]。茅莓的诸多功效与其所含的黄酮类化合物有着密切的联系，目前鲜见对茅莓不同部位总黄酮抗氧化活性的研究报道。本试验通过对茅莓根、茎、叶总黄酮体外抗氧化活性的研究，旨在为茅莓资源进一步合理综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茅莓采自山东烟台昆嵛山国家级自然保护区，经滨州医学院中西医结合学院刘孟安教授鉴定为蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus L.）植物茅莓的干燥全草，参照文献[12]中采用正交试验优化的茅莓总黄酮提取工艺分别提取茅莓根、茎、叶中的黄酮。试验动物为SD雄性大鼠，SPF级，体重200 g左右，由山东绿叶制药有限公司提供。丙二醛（MDA）测试盒和总蛋白定量测试盒（BCA法）由南京建成生物工程研究所提供，批号分别为20110729、20110804；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），纯度>96%，由阿拉丁试剂公司提供；Tris碱（AMRESCO）；水（娃哈哈牌纯净水）；乙醇、石油醚（30～60 ℃）、浓盐酸、邻苯三酚、邻二氮菲、双氧水等均为国产分析纯。仪器有TU-1901型双光束紫外可见分光光度计、FA1604s型电子天平、KQ-400DB型数控超声清洗器、PHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱、数显恒温水浴锅、台式高速冷冻离心机等。

1.2 方法

1.2.1 茅莓总黄酮的提取 分别精确称取茅莓根、茎、叶粉末各1.0 g，参照文献[12]进行总黄酮的提取。得到茅莓根、茎、叶总黄酮提取率分别为3.02、5.00、12.50 mg/g。

1.2.2 茅莓茎总黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用[13] 空白对照管：取2.0 mL的PBS（pH 7.4，下同）溶液和4.0 mL蒸馏水于试管中，混匀。未损伤管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL邻二氮菲（1.5 mmol/L，下同）、1.0 mL FeS04 溶液（1.5 mmol/L，下同）和2.0 mL蒸馏水于试管中，混匀。损伤管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL邻二氮菲、1.0 mL FeS04溶液、1.0 mL蒸馏水和1.0 mL 0.02% H2O2于试管中，混匀。样品参比管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL不同浓度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓茎总黄酮提取液和3.0 mL蒸馏水于试管中，混匀。样品管：取2.0 mL PBS、1.0 mL邻二氮菲、1.0 mL FeSO4溶液、1.0 mL不同浓度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓茎总黄酮提取液和1.0 mL 0.02% H2O2于试管中，混匀。将上述试管置于恒温水槽中，37 ℃保温60 min，于波长536 nm处测吸光度（A），根据公式（1）计算茅莓茎总黄酮提取液对羟自由基（·OH）的清除率。茅莓根和叶分别按相同方法检测。

羟自由基（·OH）清除率=[（A样品-A样参）-（A损伤-A空白）]/（A未损-A损伤）×100% （1）

1.2.3 茅莓茎总黄酮对超氧负离子（O2-）的清除作用[14] 采用邻苯三酚自氧化法[15，16]。取Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH 8.2） 4.5 mL分别与0.4 mL不同浓度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓茎总黄酮提取液混匀，室温下放置4 min，于325 nm处测定样品吸光度（Ai）。取Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL和3.0 mL 7 mmol/L邻苯三酚，于325 nm处每隔30 s测其吸光度（A0），共记录3 min。依上法，取Tris-HCl缓冲溶液4.5 mL分别与0.4 mL不同浓度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓茎总黄酮提取液混匀，在室温下放置4 min，立即加入3.0 mL 7 mmol/L邻苯三酚并开始计时，以10 mmol/L HCl为参比，于325 nm处每隔30 s测定其吸光度（A），共记录5 min。根据公式（2）计算茅莓茎总黄酮提取液对超氧负离子（O2-）的清除率。茅莓根和叶分别按相同方法检测。

超氧负离子（O2-）清除率={1-[（A-Ai）/A0]}×100%

（2）

1.2.4 茅莓茎总黄酮对有机自由基（DPPH·）的清除作用 取2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液分别与2.0 mL不同浓度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓茎总黄酮提取液混匀。30 min后以样品提取溶剂（30%乙醇溶液）为空白调零，于525 nm处测定其吸光度（Ai）；同时测定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液与2.0 mL蒸馏水混合液的吸光度（Ac）；取2.0 mL无水乙醇分别与2.0 mL不同浓度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓茎总黄酮提取液混匀，于525 nm处测定其吸光度（Aj）。根据公式（3）计算茅莓茎总黄酮提取液对有机自由基（DPPH·）的抑制率。茅莓根和叶按相同方法检测。

有机自由基（DPPH·）抑制率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

（3）

1.2.5 茅莓茎总黄酮对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化反应产物MDA的作用[17] 处死大鼠，迅速取出其肝脏，用冷生理盐水洗净后擦干水分称重，于冰水浴下用生理盐水制成10%的肝组织匀浆悬浮液。试验组分别取不同浓度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓茎总黄酮提取液0.1 mL，置10 mL玻璃试管中，再分别加入0.1 mL 10%肝组织匀浆；对照组取0.1 mL 30%乙醇溶液与0.1 mL 10%肝组织匀浆，混合均匀封好试管口置于37 ℃恒温水浴箱中温育45 min。按MDA测定试剂盒说明书进行操作，分光光度计用蒸馏水调零后于532 nm处测各组的吸光度。根据公式（4）计算茅莓茎总黄酮提取液对MDA的抑制率。茅莓根和叶按相同方法检测。

MDA的抑制率=（A对照组-A试验组）/A对照组×100% （4）

2 结果与分析

2.1 茅莓茎总黄酮对羟自由基（·OH）的清除作用

由图1可见，随着茅莓茎总黄酮浓度的增加，其对羟自由基的清除作用也随之增强，茅莓茎黄酮浓度为100 μg/mL时，对羟自由基（·OH）的清除率为56.8%。

2.2 茅莓茎总黄酮对超氧负离子（O2-）的清除作用

由图2可见，随着茅莓茎总黄酮浓度的增加，其对超氧负离子（O2-）的清除作用也随之增强，茅莓茎总黄酮浓度为10 μg/mL时，对超氧负离子（O2-）的清除率为76.0%。

2.3 茅莓茎总黄酮对有机自由基（DPPH·）的清除作用

由图3可见，在一定浓度范围内，随着茅莓茎总黄酮浓度的增加，其对有机自由基（DPPH·）的清除作用也随之增强，茅莓茎总黄酮浓度为100 μg/mL时，对有机自由基（DPPH·）的清除率为92.0%。

2.4 茅莓茎总黄酮对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化反应产物MDA的作用

由图4可见，在一定浓度范围内，随着茅莓茎总黄酮浓度的增加，其对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化产物MDA的抑制作用也随之增强，茅莓茎总黄酮浓度为100 μg/mL时，对MDA的抑制率为47.4%。

经相同的方法分别对茅莓根和叶中总黄酮的体外抗氧化活性进行研究，与茅莓茎同体积的茅莓根和叶总黄酮浓度分别为6.0、25 μg/mL时，对超氧负离子（O2-）的清除率分别为46.1%、93.4%；茅莓根和叶总黄酮浓度分别为60、250 μg/mL时，对羟自由基（·OH）的清除率分别为41.6%、88.9%，对有机自由基（DPPH·）的清除率分别为71.0%、93.0%，对MDA的抑制率分别为46.0%、45.6%。

3 小结与讨论

本试验结果表明，茅莓根、茎、叶总黄酮均具有一定的抗氧化能力，且其黄酮类化合物的添加量在试验范围内与其抗氧化性呈正相关。MDA为脂质过氧化产物，其生成的多少可以反映出组织细胞的受损程度。从试验结果可得出，茅莓中总黄酮对脂质过氧化有一定的抵抗能力，且与黄酮浓度呈量效关系。同体积的茅莓根、茎、叶黄酮提取液对羟自由基（·OH）、超氧负离子（O2-）、有机自由基（DPPH·）均具有清除能力，对大鼠肝组织匀浆自发性脂质过氧化产物MDA均有一定的抑制作用。由于茅莓叶中黄酮含量相对较高，因此其体外抗氧化活性相对较高。茅莓根、茎、叶中的黄酮对超氧负离子（O2-）和有机自由基（DPPH·）的清除能力相对较强。自由基（Free radical，FR）是外层轨道上有不成对电子的原子、原子团或分子的总称，通常包括羟自由基（·OH）、超氧负离子自由基（O2-）、有机自由基（DPPH·）等。高浓度的自由基能够破坏细胞成分，对机体十分危险，可使得糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等发生氧化，遭受损伤与破坏，从而引发衰老、脑缺血、帕金森氏症、风湿性关节炎、呼吸窘迫综合征、心血管疾病和癌症等疾病[18，19]。通过对羟自由基（·OH）、超氧负离子（O2-）和有机自由基（DPPH·）清除作用的研究发现，茅莓中黄酮对3种自由基均具有良好的清除作用，对3种自由基的清除作用均随其浓度的增加而增强，呈明显的量效关系，这种抗氧化能力来自于其酚羟基的供氢或供电子能力，从而与活性氧发生氧化还原反应。这一研究为进一步开发利用茅莓资源提供了一定的理论基础。

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