肝郁脾虚证模型大鼠免疫细胞分化和增殖变化规律研究

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摘要：目的 探讨实验条件下的肝郁脾虚证大鼠骨髓和外周血淋巴细胞和中性粒细胞分化和增殖的变化规律。方法 采用夹尾激怒、束缚应激、过度疲劳与饮食失节的复合方法复制肝郁脾虚证动物模型。检测空白对照组和模型2、6、9周组雄性大鼠外周血象、骨髓象和骨髓细胞增殖周期。结果 外周血象显示：与空白对照组比较，模型大鼠2周组白细胞和中性粒细胞数量升高（P

关键词：肝郁脾虚证；外周血细胞；骨髓象；骨髓细胞周期；大鼠

中图分类号：R256.49；Q95-33 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）01-0043-03

肝郁脾虚证是临床常见证候之一，有研究表明肝郁脾虚证患者常有免疫功能低下的临床表现[1-2]。本研究拟通过动物实验来探讨肝郁脾虚证对血液免疫细胞分化、增殖的影响，为中医脏腑辨证和“证”本质的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wistar雄性大鼠40只，体质量（200±10）g，甘肃中

医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2001- 0001-0001122；设施许可证号：SYXK（甘）2011-0001-0002704）。

1.2 仪器

950S动物血球分析仪（HEMAVET，美国），Biofuge Primo离心沉淀器（Heraeus，德国），350DSQ大鼠固定器（上海中胜公司），流式细胞仪（Beckman，美国），骨髓细胞分析系统（重庆天海公司）。

1.3 造模与分组

采用夹尾激怒+束缚应激+过度疲劳+饮食失节的复合方法复制肝郁脾虚证动物模型[3-4]，为避免大鼠较长时间造模产生适应，其中夹尾激怒+束缚应激每日选择一种因素和过度疲劳配合进行。造模大鼠每5只分装于一笼，每日上午9：00夹尾激怒，先将同笼5只大鼠中的3只用铁文件夹钳夹鼠尾远端1/3处，以不破皮为度，令其暴怒，寻衅与其他大鼠撕打或尝试转头咬掉夹子，激怒全笼大鼠，15 min后再交换钳夹另2只大鼠，连续不断地刺激，总时间30 min，每日上午2次；束缚应激时造模大鼠于每日上午9：00置于束缚盒中限制3 h；下午2：00将夹尾激怒或束缚应激后大鼠置于盛有温水（22±1）℃的大塑料桶中游泳10 min造成过度疲劳。隔日喂食（隔日禁食，隔日足量给食），饮水不限。

40只实验大鼠按随机数字表法分为空白对照组及肝郁脾虚2、6、9周组，每组10只。

1.4 检测指标与方法

分别在2、6、9周将造模组大鼠10只取血和骨髓进行检测，空白对照组10只与9周组同步采样检测。采用股动脉放血，其中1 mL抗凝血混匀，立即检测外周血常规。快速取大鼠双侧股骨，取左侧股骨骨髓，瑞氏染色做骨髓涂片；取右侧股骨骨髓细胞，过滤制成单细胞悬液，按要求固定细胞，放置4 ℃冰箱冷藏备用。

取固定的细胞样品，按操作方法染色，上流式细胞仪检测细胞周期的变化，结果以细胞周期各时相细胞百分率表示，并计算细胞增殖指数（PI）[5]：PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。光学显微镜下观察骨髓涂片，分类计数500个有核细胞并计算其百分比。

1.5 统计学方法

采用SPSS11.0统计软件进行分析，计量资料以―x±s表示，组间差异的比较采用方差分析，检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

空白对照组大鼠较活跃，整洁，饮食如常，粪便成形，精神状态良好；肝郁脾虚证大鼠造模1周时呈现急性躁狂，挣扎撕咬，游泳耐力尚可；而第2、3周开始逐渐呈现慢性应激时的抑郁状态，体质量增长缓慢，反应迟钝、扎堆、倦卧，饮食少，大便稀、污秽，被毛枯黄蓬乱，形成“肝郁脾虚证”表现，表明造模成功。

2.2 各组大鼠外周血常规检测结果比较（见表1）

2.3 各组大鼠骨髓象检测结果（见表2）

2.4 各组大鼠骨髓细胞增殖周期变化（见表3）

3 讨论

中医理论认为，肝主藏血，主疏泄，具有疏通、畅达全身气机，进而促进气血津液的运行输布；脾主运化，主摄血，为“气血生化之源”，脾气健运，血液化生充足。肝脾两脏对血液生成和输布具有重要调节作用。肝郁脾虚证是以肝失疏泄、脾失健运为核心病机的一种证候。随着现代生活节奏的加快，社会竞争日益激烈，精神压力、疲劳和饮食不规律等不良负性刺激引起机体内环境稳态失衡，导致肝郁脾虚型亚健康状态的患者日益增多。故本研究通过动物实验研究来揭示肝郁脾虚证大鼠免疫细胞分化、增殖变化规律，为脏腑辨证提供实验依据。

本实验外周血象检测结果表明，机体处于肝郁脾虚状态时会发生非特异全身反应，以增强抵抗恶劣环境的能力。在短期应激状态下，下丘脑-腺垂体-肾上腺皮质轴兴奋性提高，糖皮质激素在血中浓度增加。该激素增强骨髓造血，可使附着于血管壁的中性粒细胞进入血液循环，中性粒细胞增多使机体抗感染能力增强[6]。但长期刺激反而造成淋巴细胞数量减少，免疫力降低。

细胞周期各个时相的分布情况可以反映细胞增殖的状态[7]，本实验通过检测骨髓细胞周期来反映肝郁脾虚对骨髓细胞增殖的影响；骨髓象检测可直观反映各类有核血细胞形态和比例，也可观察分析各系细胞分化和增殖情况。骨髓检测结果表明，骨髓在肝郁脾虚的不同阶段其免疫细胞的分化和增殖也发生了一定改变，在较短的2周刺激时，骨髓增殖能力增强，生成和释放大量中性粒细胞入血，提高机体抵抗力。但随着刺激时间延长，6周或9周的慢性刺激下，其增殖能力已出现一定程度的回落。实验检测到慢性刺激时骨髓象淋巴细胞比例增多而外周血淋巴细胞的数量减少，说明到后期骨髓代偿性增殖已不能对抗神经-内分泌网络紊乱对免疫机能的影响，持续升高的糖皮质激素抑制淋巴细胞的有丝分裂，促进其凋亡，使胸腺、淋巴结萎缩，抑制T淋巴细胞的成熟[6]，最终导致外周血淋巴细胞 数量减少、免疫抑制。

与临床肝郁脾虚证复杂的致病因素相比，实验研究只能部分模仿和复制与之表现接近的动物模型，而且实验设置最长刺激时间为9周，与临床经年累月的因素影响也有一定差距。本研究结果显示，刺激时间较短时动物主要以肝郁症状为主，而长期慢性刺激则表现为逐渐加重的以脾虚为主的症状，对骨髓增殖也有一定的影响，众多因素共同作用使机体出现免疫低下的血液学改变。

参考文献：

[1] 王天芳，焦扬，郑君芳，等.消疲怡神口服液对肝郁脾虚型慢性疲劳综合征病人免疫功能的调节作用[J].北京中医药大学学报，2000，23（增刊）：32.

[2] 赵建明，刘艳峰，孔筠，等.肝郁脾虚型慢性疲劳综合征患者焦虑抑郁状态及淋巴细胞凋亡的临床研究[J].山西中医，2004，20（4）：48.

[3] 李艳彦，谢鸣，陈禹，等.一种运用复合病因造模法复制大鼠肝郁脾虚证模型的研究[J].中国中医基础医学杂志，2006，12（6）：439-442.

[4] 韩秋艳.肝郁脾虚证动物模型的建立[J].贵阳中医学院学报，2001， 23（3）：59-61.

[5] 张新胜，祝彼得，黄晓芹，等.红景天苷对骨髓抑制贫血小鼠骨髓细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响[J].四川大学学报：医学版，2005，36（6）：820-823.

[6] 姚泰.生理学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2010：82-83，580-584.

[7] 谭洪玲，马增春，肖成荣.四物汤对3种血虚证动物细胞周期的影响[J].药学学报，2010，26（2）：158-161.

（收稿日期：2012-07-05，编辑：华强）