淡竹叶中一个新的黄酮碳苷

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[摘要]采用各种色谱技术对禾本科淡竹叶属植物淡竹叶进行分离纯化，并通过理化常数、波谱数据及化学方法鉴定化合物的结构。从中分离得到了1个化合物，鉴定其结构为3′-甲氧基木犀草素6-C-β-D-半乳糖醛酸基-（12）-α-L-阿拉伯糖苷（1），为1个新的黄酮碳苷类化合物。

[关键词]淡竹叶；禾本科；黄酮碳苷；3′-甲氧基木犀草素6-C-β-D-半乳糖醛酸基-（12）-α-L-阿拉伯糖苷

[收稿日期]2013-10-16

[基金项目]国家自然科学基金项目（81072535）；广州市科技计划项目（2011Y1-00017-2）

[通信作者]*叶文才，教授，博士生导师，Tel：（020）85220936， Fax：（020）85221559， E-mail：

[作者简介]赵慧男，博士，研究生，实验师，主要从事天然药物化学研究，Tel：（020）85221559， E-mail： 中药淡竹叶为禾本科Gramineae淡竹叶属植物淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.的干燥茎叶，广泛分布于浙江、安徽、湖南、四川、湖北、广东、江西等省区[1]。淡竹叶性寒、味甘，具清热、除烦、利尿等功效，民间常用于治疗呼吸道感染所引起的感冒、发热等疾病[2]，也是广东凉茶（如二十四味凉茶和王老吉凉茶）重要的组方药材。前期的化学成分研究显示，淡竹叶中主要含有黄酮、三萜及酚酸类成分[3-5]。现代药理研究表明，淡竹叶具解热、利尿、抗菌、抗肿瘤等多种药理作用[6]，但其药效作用物质基础尚不明确。为探索淡竹叶的活性成分，本课题组前期曾对其进行了系统的化学成分研究，从该植物中分离鉴定了一系列黄酮及其苷类成分[7-9]，其中6位单糖取代的黄酮碳苷类成分显示出显著的体外抗呼吸道合胞病毒（RSV）活性[8]。在本课题组的进一步研究中，又从该植物中分离得到了1个新的黄酮碳苷类化合物，并通过波谱和化学方法鉴定其结构为3′-甲氧基木犀草素6-C-β-D-半乳糖醛酸基-（12）-α-L-阿拉伯糖苷（1）。随后的抗病毒活性测试结果显示，该化合物并未表现出明显的抗RSV活性，进一步证实了6位单糖碳苷取代应为该类化合物抗病毒活性的必需基团。

1材料

JASCO P-1020型旋光仪；X-5型显微熔点测定仪（温度计未校正）；JASCO V-550型紫外-可见分光光度仪；JASCO FT/IR-480 Plus Fourier Transform型红外光谱仪（KBr压片）；Bruker AV-400型核磁共振波谱仪；Agilent 6210 LC/MS TOF型质谱仪；Shimadzu GCMS-QP2010型气质联用仪；Agilent 1260系列高效液相色谱仪；柱色谱用硅胶（100～200，200～300目）为青岛海洋化工厂产品；HP-20型大孔吸附树脂为日本三菱化工有限公司产品；硅胶GF254薄层预制板为烟台化学工业研究所产品；Sephadex LH-20为Pharmacia公司产品；分析用HPLC色谱柱为Cosmosil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；制备型HPLC色谱柱为Cosmosil C18色谱柱（20 mm×250 mm， 5 μm）；所用试剂均为分析纯或色谱纯。实验所用药材购自广东省广州市清平药材市场，由暨南大学中药及天然药物研究所周光雄教授鉴定为禾本科淡竹叶属植物淡竹叶L. gracile的干燥茎叶，标本（No. 20100320）现存放于暨南大学中药及天然药物研究所。

2提取与分离

干燥的淡竹叶药材10.0 kg粉碎后经70%乙醇渗漉提取，回收溶剂得浸膏（约750 g）。将浸膏用低浓度醇溶解后经脱脂棉滤过，滤液上HP-20型大孔吸附树脂柱，分别用蒸馏水及20%，60%，95%乙醇梯度洗脱。20%乙醇洗脱部位浓缩后得浸膏120 g，经硅胶柱色谱分离（氯仿-甲醇-水梯度洗脱，100∶0∶0～30∶70∶0.1），共得到7个主流分（Fr.1～Fr.7）。Fr.5经Sephadex LH-20柱色谱分离（30%甲醇洗脱）去除色素后，进一步经制备型HPLC分离纯化[Nacalai Tesque Cosmosil C18色谱柱（20 mm× 250 mm， 5 μm），流动相为15%甲醇，流速为6 mL・min-1]，得到化合物1（15 mg）。

3化合物的结构鉴定

化合物1为黄色无定形粉末，mp 208～213 ℃，[α]25D+3.5（c 0.02， MeOH）。香草醛-浓硫酸反应显黄色，HCl-Mg反应和Molish反应均呈阳性，化合物1的UV光谱在205，256，350 nm处有最大吸收；IR谱提示含有羟基（3 407 cm-1）、羧酸羰基（1 723 cm-1）、α，β-不饱和羰基（1 648 cm-1）和芳环（1 621，1 504 cm-1），以上信息提示1为黄酮苷类化合物。HR-ESI-MS谱中，显示准分子离子峰m/z 609.146 0 [M+H]+（计算值609.145 0），可推断该化合物的分子式为C27H28O16。化合物1酸水解后，衍生化产物经气相分析并与对照品对照，可确定该化合物中含有D-半乳糖醛酸。

化合物1的1H-NMR谱在低场区显示出6个氢信号：其中δH 13.62（1H， br s）处的活泼氢信号为黄酮类化合物5-OH的特征信号；δH 7.54（1H， dd， J=8.9， 2.0 Hz， H-6′），7.53（1H， d， J=2.0 Hz， H-2′）和6.94（1H， d， J=8.9 Hz， H-5′）处为一组ABX偶合系统的芳香氢信号，提示该化合物中含有1个1，3，4-三取代苯环的结构片段；δH 6.43（1H， s）和6.80（1H， s）处信号可分别归属为黄酮类化合物母核上H-8和H-3的信号，以上信息提示化合物1的苷元为木犀草素。1H-NMR谱中在δH 4.55（1H， d， J=9.8 Hz， H-1″）和4.22（1H， d， J=7.8 Hz， H-1）处出现了2个糖的端基氢信号；此外，δH 3.90（3H， s）处还显示出1个甲氧基的质子信号。

化合物1的13C-NMR谱共显示出27个碳信号，结合DEPT-135谱可知其中包括1组黄酮苷元碳信号、2组糖信号及1个甲氧基碳信号。综合化合物1的1H，13C-NMR，1H-1H COSY，HSQC，HMBC和ROESY谱信息，对其碳氢信号进行了全归属，1H，13C-NMR数据见表1。

以上化合物1的碳氢数据与已知化合物木犀草素6-C-β-D-半乳糖醛酸基-（12）-α-L-阿拉伯糖苷相似[8]，其不同之处在于化合物1多出了1组甲氧基的氢碳信号[δH 3.90（3H， s）和δC 55.9]，且其归属于木犀草母核的3′位碳信号向低场位移约2.2（δC 145.7147.9）。提示，化合物1为木犀草素苷、马钱苷、丹皮酚4种主要成分为指标，建立了基于多指标成分同时检测的六味地黄浓缩丸溶出度测定方法，符合中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，为科学合理地制定其溶出度质量标准提供研究基础和方法。

本研究还比较了不同厂家六味地黄浓缩丸的溶出度差异，结果显示，7个厂家生产的六味地黄浓缩丸中4种成分溶出度存在较显著的差异。虽然各厂家均按照《中国药典》所载制法制备六味地黄浓缩丸，但是工艺参数可能不一致，如饮片粉碎粒度、药粉混合均匀度、提取浓缩过程工艺参数、浸膏的相对密度、软材的制备方法、丹皮酚的加入方式、抛光的工艺参数、干燥的方式、温度和时间等[5]，这些工艺参数的不同都将导致六味地黄浓缩丸溶出度的差异，从而影响其临床疗效。

体外溶出度试验在一定程度上可以预测药物的体内溶出状况[8-9]，是证明药物体内释放特性的一种简单、廉价而不失严谨的实验室检测方法[2]。复方中药体外溶出同步至关重要，只有在体内同步释放、吸收才能达到复方中药相辅相成、相互协同的目的[10]。本研究比较了不同厂家六味地黄浓缩丸中4种成分的溶出同步性，结果显示，厂家B，C，E，F，G中4种成分具有溶出同步性。

六味地黄浓缩丸中还有毛蕊花糖苷（熟地黄）、尿囊素（山药）、23-乙酰泽泻醇B（泽泻）、茯苓酸（茯苓）等化学成分，但可能由于这些成分在饮片中的含量不高或对热不稳定，经过提取、浓缩、干燥等复杂的制备工艺后，在六味地黄浓缩丸中的含量较低而未能检出，下一步将采用液-质联用等更灵敏的检测方法进行研究。此外，为了制定更为科学合理的溶出度质量标准，还有必要进一步研究体内-体外的相关性。6-C-β-D-半乳糖醛酸基-（12）-α-L-阿拉伯糖苷的C-3′位羟基甲基化衍生物。

在ROESY谱中，半乳糖醛酸的端基质子H-1（δH 4.21）与阿拉伯糖的端基质子H-1″（δH 4.56）有远程相关，可确定β-D-半乳糖醛酸连于阿拉伯糖的C-2″位成氧苷。在HMBC谱中，阿拉伯糖的端基质子信号H-1″（δH 4.56）与黄酮苷元的C-5（δC160.6），C-6（δC108.0）和C-7（δC163.9）有远程相关，可确定α-L-阿拉伯糖连于黄酮苷元的C-6位上成碳苷，即化合物1与已知化合物木犀草素6-C-β-D-半乳糖醛酸基-（12）-α-L-阿拉伯糖苷具有相同的糖链结构和连接位置。此外，在HMBC谱中可观察到δH 3.90（3H， s）与δC 147.9（C-3′）有远程相关；在ROESY谱中，可观察到甲氧基质子信号δH 3.90（3H， s）与δH 7.53（1H， d， J=2.0 Hz， H-2′）]有NOE相关，可确证化合物1中甲氧基连在母核的C-3′位。综合以上解析，鉴定化合物1的结构为3′-甲氧基木犀草素6-C-β-D-半乳糖醛酸基-（12）-α-L-阿拉伯糖苷[3′-methoxyl-luteolin 6-C-β-D-galactopyranosiduronic acid（12）-α-L-arabinopyranoside]，为1个新的黄酮碳苷类化合物见图1。

表1化合物1的氢碳核磁共振波谱数据（DMSO-d6）

Table 11H（400 MHz） and 13C（100 MHz） NMR spectral data of compound 1（DMSO-d6）

图1化合物1的结构式及其关键的二维相关

Fig.1Chemical structure of compound 1 and its key HMBC and ROESY correlations

4化合物的酸水解和糖的衍生化反应

取化合物1约3 mg，加入2 mol・L-1的HCl 10 mL，热回流2 h。反应产物用氯仿萃取2次，取水层减压浓缩，残留物加入无水吡啶1 mL溶解，再加入半胱氨酸甲酯盐酸盐3 mg，混合物置于80 ℃烘箱中反应2 h。反应产物用氮气彻底吹干，加入四甲基硅烷咪唑200 μL，置于80 ℃烘箱中反应1 h，加约1 mL水终止反应。反应产物用等体积环己烷萃取，环己烷层浓缩至约200 μL，以备GC分析。取D-半乳糖醛酸对照品，按照上述方法处理。最后将环己烷层溶液进行GC分析（进样口温度270 ℃，柱温250 ℃），结果显示，D-半乳糖醛酸水解产物的保留时间tR=31.514 min，化合物1的水解产物的保留时间tR=31.411 min，表明化合物1中含有D-半乳糖醛酸[8]。

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A new flavone C-glycoside from leaves of Lophatherum gracile

ZHAO Hui-nan， CHEN Mei， FAN Chun-lin， WANG Ying， LI Yao-lan， YE Wen-cai*

（Institute of Traditional Chinese Medicine & Natural Products， College of Pharmacy， Jinan University；

Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of Traditional Chinese Medicine and

New Drugs Research， Jinan University， Guangzhou 510632， China）

[Abstract]Several kinds of column chromatography method were used to investigate the chemical constituents of the leaves of Lophatherum gracile. The structures of the isolated compounds were identified based on their physicochemical properties and spectral data. A new flavone C-glycoside was isolated and its structure was identified as 3′-methoxyl-luteolin 6-C-β-D-galactopyranosiduronic acid（12）-α-L-arabinopyranoside（1）.

[Key words]Lophatherum gracile； Gramineae； flavone C-glycoside； 3′-methoxyl-luteolin 6-C-β-D-galactopyranosiduronic acid（12）-α-L-arabinopyranoside

doi：10.4268/cjcmm20140216