我国木兰科植物组织培养研究进展

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摘要：文章论述了木兰科植物组织培养研究的进展，对相关工作人员工作的开展有一定借鉴意义。

关键词：木兰科；基本培养基；诱导生根

中图分类号：Q944.6 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2010）-09-0035-4

木兰科（Magnoliaceae）植物是世界著名的观赏园林绿化植物，有些树种亦是我国传统的中药材。木兰科属种资源丰富，全世界共有15属250种，其中我国自然分布有11属130种，占世界总属的37%，总种的52%，居世界各国的首位[1]。木兰科植物在系统发育中是一个最古老的类群，在被子植物中受到的威胁最多，是探索被子植物起源、发展和建立被子植物自然系统不可缺少的材料[2，23]。随着实际应用的发展，木兰科植物种质资源越来越欠缺，有30多种已被列入我国珍惜濒危保护植物的名单之中[16]。所以越来越多的科学工作者关注木兰科属种资源的保护和资源开发问题。生物技术的发展，无疑给木兰科植物的种质保存提供了非常好的理论基础，有不少人开始利用组织培养技术进行木兰科植物的种质保存和资源开发[3-8，10-15]。但大部分尚处于初步探索阶段，根据资料记载，由组织培养诱导不定芽成功的仅在二乔玉兰（Magnolia soulangeana）[8，17]、白玉兰（Magnolia denudata）[7，32-33]、广玉兰（Magnolia grandiflova）[11，17，37]、荷花玉兰（Magnolia grandiflor L.）[22]、紫玉兰（Magnolia liliflora Desr）[24-33]、天女木兰（Magnolia sieboldii K.Koch）[38]、凹叶厚朴[Maganolia biloba (Rehd et Wlis)Cheng][5]、川厚朴(Magnolia officinalia Rehd et Wils)[18]、巴东木莲(Manglietia patungensis Hu)[20]、深山含笑（Michelia maudiae Dunn.）[6]、金叶含笑（Michelia foveolara Merr.et Dandy）[17]、长蕊含笑(Michelia longistamina)[17]、阔瓣含笑(M.Platypetala Hand-Mazz.)[17]、峨眉含笑(Michelia wilsonii)[17]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、火力楠（Michelia macclurei）[10，17]、乐东拟单性木兰[Parakmeria lotungensis（Chun et C.Tsong）Law][17，21]、云南拟单性木兰（Parakmeria yunnanensis Hu）[36]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]、北美鹅掌楸（Liriode ndron tiliptera）[17]、鹅掌楸（Liriodendron chinense Sarg.）[12，15，17]、杂交鹅掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[4，13，14，17，39]等几十个种有报道，但经愈伤组织或不定芽诱导生根的成功例子仅在鹅掌楸（Liriadeadron chinease Hemsi Sarg）[12、15]、杂交鹅掌楸（Liriodendron Chinese×L.tulipifera ）[39]、白玉兰（Michelia alba）[7]、紫玉兰（Magnolia liliflora Desr）[24]、云南拟单性木兰[36]、巴东木莲(Manglietia patungensis Hu)[3，20]、深山含笑（Michelia maudiae）[6]、醉香含笑（Michelia macclurei Dandy）[34]、五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[19]、北五味子（Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.）[35]等极少树种中有报道，而愈伤组织内次级代谢产物的研究分析未见有报道，见表1。本文就木兰科植物组织培养的研究现状做一综述。

1 基本培养基和外植体的选择

木兰科植物都是木本或木质藤本，所以在外植体的选择上常用顶芽、腋芽、嫩茎段，而叶、叶柄、托叶等外植体在脱分化并诱导愈伤组织产生上效果并不佳。一般而言，芽诱导产生愈伤组织的能力最强，而叶柄次之，叶片最低。这在鹅掌楸属[4，12，14，17，39]、含笑属[6，25，34]、木兰属[24，31]等的研究结果是一致的。在荷花玉兰的组织培养[22]中发现，花托产生的愈伤组织紧密肿胀，诱导率最高，叶芽次之，而雄蕊、雌蕊及花被片不易产生愈伤组织。这一点可以启迪我们在其他属的外植体选择上可以拓开思路。王碧琴对7种木兰科植物进行组织培养，研究结果认为：越是幼嫩的组织部分，越易形成愈伤组织，同时，易产生愈伤组织的外植体，很难分化出不定芽，所以在外植体的选取上，要从实际需要出发，根据植物个体性状，做具体选择，对于诱导不定芽，苗质组织较疏松的外植体，稍微取成熟部位并要多留茎节及生长点[17]。

合适的基本培养基是组织培养成功的一个重要因素，不同植物培养所要求的基本培养基有差异。目前植物培养采用的基本培养基主要为MS、B5、WPM、1/2MS等，每种培养基中盐浓度不同，培养基中盐浓度对外植体褐变和试管苗玻璃化均有影响。由表1可看出，木兰科鹅掌楸属植物的组织培养80%以上采用MS或改良的1/2MS，此外，WPM、1/2WPM、改良的Risser和White培养基也适合鹅掌楸的组织培养[12，14]。含笑属植物的组织培养常采用MS[6，25，34]，生根时采用1/2MS或1/4MS。木兰属组培[5，7，18，22，24，31，32]中常用B5、MS培养基，在根的诱导上用1/2B5、、1/2MS或1/4MS，说明适当降低基本培养基中矿质离子的质量浓度有利于根的产生和生长。

2 培养基配比对愈伤组织产生的影响

2.1 植物生长调节剂物质

基本培养基提供给外植体最基本的物质条件，使外植体生存并保持最低的生理活性，而植物生长调节剂能诱导细胞分裂、愈伤组织生长以及根芽的分化，常用的植物生长调节剂有：生长素类和细胞分裂素类。生长素类的主要作用是启动有丝分裂，恢复植物细胞的分裂能力，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。细胞分裂素主要作用是促进细胞分裂和扩大，诱导芽的分化、侧芽的萌发生长而抑制茎的伸长，使茎增粗，常用的细胞分裂素有激动素（KT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）、噻二唑苯基脲（TDZ）等。细胞分裂素和生长素常配合使用，使外植体生长和诱导效果更强。一般而言，植物生长激素通常被用来诱导愈伤组织形成和增殖，植物的生根多数是用生长素单独实现。而愈伤组织产生后的增殖、分化再生植株或诱导细胞胚时，生长素应相应降低浓度或祛除，而细胞分裂素浓度适当提高。植物组织培养的器官发生途径可分为：直接器官发生途径和间接器官发生途径，前者是指以芽或带芽茎段直接诱导不定芽然后得再生植物，后者是指外植体经愈伤组织再诱导芽的再生途径[3]。不同的器官发生途径，在激素的选择上有所不同。孙雁霞等[18]对川厚朴愈伤组织培养的研究中未用到6-BA，只用2，4-D和NAA，因其主要针对愈伤组织的增殖，所以没有用到细胞分裂素。王琪[22]利用荷花玉兰的花托和叶芽诱导愈伤组织，发现：2，4-D+NAA+IAA/6-BA的比值越大，愈伤组织诱导率越高，生长量越大。而刘贤旺等[5]对凹叶厚朴组织培养试验中利用较高浓度的2，4-D（2mg/L）和较低浓度的6-BA（1mg/L）诱导愈伤组织的产生，愈伤组织的生长则适当降低2，4-D的质量浓度（1.0mg/L），提高6-BA的质量浓度（1.5mg/L）。在不定芽诱导后的增殖中，醉香含笑[34]、五味子[19]提高生长素/细胞分裂素的比值对不定芽有明显的增殖效果，这与刘贤旺的愈伤组织增殖所需的激素配比恰恰相反。田敏[4]对杂交鹅掌楸的研究结果表明：高质量浓度的6-BA（2.0-4.0mg/L）能促进愈伤组织形成与不定芽的分化，蒋泽平等人[39]的研究结果与之相同，在其他因子不变的情况下，细胞分裂素所含质量浓度愈高，启动越快，丛生芽也较多，由此看来细胞分裂素是诱导外植体脱分化和直接器官发生的关键因子。纵观表1的实验结果，激素的配比是因植物种类而异的，不可一概而论，而且激素配比是组织培养关键因素，在基本原理的指导下，我们只有通过不断的摸索才能筛选出最佳的配比。木兰科植物组织培养常用的激素种类有：2，4-D、NAA、6-BA等。浓度范围分别为：2，4-D（0.1，1-3mg/L）、NAA（0.02-0.5mg/L，4mg/L）、6-BA（1-3mg/L）。王琪在荷花玉兰组织培养中NAA的应用达到4mg/L。此外IAA、KT、ZT、TDZ、BAP、IBA对木兰科植物也是有效的生长调节物质，据报道，TDZ对木本植物组织培养来说最有效，已经应用于多种木本植物组织培养体系的建立[39，26，27]。

2.2 非植物生长调节物质

在基本培养基中除加入一定配比的植物生长调节物质外，还常加入一些非植物生长调节物质，如营养物质椰乳、水解乳蛋白、谷氨酰氨、苹果汁、香蕉汁、豆芽汁等。木兰科珍稀濒危植物巴东木莲在丛生芽的诱导时添加了10%的椰乳[3，20]，形成丛生芽苗，而未加椰乳的培养基中仅少数能丛生芽苗。刘贤旺比较了豆粉、水解乳蛋白、苹果汁、香蕉汁、豆芽汁5种天然附加物对凹叶厚朴愈伤组织生长的影响，发现在培养基中添加10%豆芽汁能迅速促进愈伤组织生长。Civinova-B在研究树木茎段培养时发现，加入天冬酰胺和谷氨酰胺能提高愈伤组织分化为芽的比率[44]。

3 诱导生根

木兰科植物在愈伤组织诱导、不定芽产生、生根方面均较难[6，7，9]。以快速繁殖为目的的植物组织培养，诱导生根后方可用于工厂化快繁生产。木兰科植物的组织培养只有含笑属、木兰属、鹅掌楸属等几个属的树种有成功诱导生根的报道。陈金慧对鹅掌楸组培苗的生根及移栽技术研究结果表明：适当降低矿质元素的1/2MS培养基，附加IBA0.1mg/L生根效果较好，同时活性碳的使用可以有效提高组培苗的生根率。另外，生根能力随所采集外植体的母本植物的年龄增加而下降。而蔡桁等对鹅掌楸组织培养技术研究结果表明：在生根培养中，以基本培养基WPM或1/2WPM添加NAA1.0mg/L最好，而在1/2MS+IBA0.2mg/L+NAA0.1mg/L+ABT0.1mg/L组合的培养基的生根率为60%。在以WPM或1/2WPM为基本培养基进行生根培养时，必须采用24h光照培养或先暗处理7-14天再用24h光照培养。由此看来，在鹅掌楸的生根培养中，选择合适的生长素类物质及浓度，适当降低基本培养基的矿质元素，控制好光照是鹅掌楸试管苗生根要重点考虑的因素，此外，活性炭的使用，吸收了培养基中的有毒物质，防止褐变，也能大大提高生根率。乐东拟单性木兰在1/2MS+NAA0.3mg/L+IBA0.2mg/L的培养基上，添加15g/L活性炭有利于生根[21]。楮建民在白玉兰离体培养和快速繁殖中用到的生根培养基为：1/2B5+NAA0.5mg/L+AC1.0mg/L+VB20mg/L[7]。曾宋君在对深山含笑进行快速繁殖时认为：试管内小苗在1/2MS+NAA0.5mg/L的培养基上生根壮苗效果较好。周鑫对五味子组织培养中，生根培养基加入吲哚丁酸2mg/L，由此看来，适当降低培养基中的矿质浓度，添加适量的生长素类激素和活性炭有利于木兰科植物试管苗的生根。而在巴东木莲[20]生根诱导时除了以上条件的满足外，还添加了BA0.05mg/L，但这种情况在木兰科其他植物中不常见。

4 木兰科植物组织培养中常见问题

木兰科植物体内含有较多的酚类化合物，由于褐变引起组织培养失败，已成为快速繁殖体系建立的一大障碍。褐变产生的原因与植物种类、基因型、外植体部位、生理状态、培养基成分及培养条件等有关[42]，此外，接种中外植体大小与褐变也有关系，有报道[43]：当茎尖小于5mm时褐变严重，而7-15mm较轻。对褐化现象的机理研究及解决的方法等有较多的文献报道。目前普遍认为褐变的机理有两类：非酶促褐变和酶促褐变。非酶促褐变，不涉及酶类物质的产生，当细胞适应了胁迫环境就不在发生褐变[8]。酶促褐变是植物组织培养中褐变的主要因素，酶促褐变的发生必须具备3个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸转氨酶，引起褐变的底物主要是酚类化合物。苏梦云对乐东拟单性木兰茎段愈伤组织诱导与褐变控制的研究表明：抗氧化剂控制褐变的效果比吸附剂好，以抗坏血酸最好，其次是巯乙醇和二硫苏糖醇[21]。参照已有的控制褐变的文献报道，对于木兰科植物在组织培养中出现的褐变问题提出以下几点建议：春季取外植体，外植体以顶芽最好；在抗氧化剂溶液中切割、剥离外植体，尽可能减少伤口切割面积；对外植体进行低温冷藏处理；选用专门的木本植物培养基如WPM，或降低基本培养基中的无机盐浓度，如采用1/2MS；初期培养可在黑暗或弱光下进行；在培养基中加入适量的抗褐变剂或吸附剂，如：抗坏血酸、植酸、硫代硫酸钠、硝酸银、活性炭、聚乙烯吡咯烷酮等；在培养过程中进行细胞筛选或多次转瓶。

5 木兰科植物组织培养的前景展望

木兰科是研究被子植物系统演化非常重要的科，其植物资源的多样性是系统理论研究的基础。此外，在实际应用中，其许多植物在医药、化工、园林等方面有着广阔的应用前景。而木兰科大多为木本，稀藤本，分布区域狭窄，采种困难，扦插嫁接成活率不高，资源保护和开发比草本植物难度要大。利用组织和细胞培养技术可以对木兰科植物进行快速繁殖、药物生产、新品种开发等。如鹅掌楸、白玉兰等植物已建立了较好的快繁体系，但大多数木兰科植物还在摸索阶段。姜长阳利用γ射线结合组织培养，选育出了一年开两次花，生长快，抗逆性强的玉兰新品系[30]，为园林绿化植物增添了亮丽的一色。通过组织和细胞培养生产次生代谢产物，已在人参、硬紫草上实现了工业化。西洋参、长春花、雪莲、红豆杉、青蒿等植物通过细胞培养生产次生代谢产物方兴未艾。木兰科植物利用组织和细胞培养生产药物的研究起步较晚，童再康进行了厚朴组织培养和高产细胞系建立的研究，比较了不同愈伤组织内的酚类物质含量[30]。木兰科植物利用组织和细胞培养生产药物和香料等方面值得我们不断深入研究。

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作者简介：刘叶蔓（1975-），女，湖南新化人，湖南中医药大学讲师，研究方向：药用植物生物技术的研究。