基于16S rDNA序列比对分析赣南脐橙上柑橘黄龙病病原的分子特征

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摘 要: 运用PCR技术以柑橘黄龙病病原亚洲种、非洲种和美洲种特异性引物对赣南脐橙上7个代表性柑橘黄龙病样品进行扩增检测，结合限制性内切酶XbaⅠ对赣南脐橙上的黄龙病病原16s rdna基因RFLP分析和测定的16S rDNA基因序列同GenBank登录的亚洲种、非洲种和美洲种的相应基因序列进行比对分析。结果表明，在赣南脐橙上检测到黄龙病病原亚洲种，未检测到非洲种和美洲种；赣南脐橙上黄龙病病原16S rDNA基因 XbaⅠ酶切具有亚洲种图谱；16S rDNA基因序列比对分析表明7个赣南脐橙上的黄龙病病原间同源性为99.8%~100%，与亚洲种具有98.4%~99.9%的序列同源性，高于与非洲种/美洲种的序列同源性；与亚洲种间遗传距离小于与非洲种/美洲种间的遗传距离；系统聚类分析表明7个赣南脐橙上的黄龙病病原同亚洲种聚类在同一组群，具有较高的同源性和较近的亲缘关系，而与非洲种和美洲种在系统发育树中分属不同的组群，试验结果表明赣南脐橙上感染的黄龙病病原为亚洲种。

关键词: 赣南脐橙； 柑橘黄龙病； 16S rDNA； RFLP分析； 序列比对

中图分类号：S666．4 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－1099－05

Molecular characterization of Citrus Huanglongbing Bacteria in Gannan navel orange based on 16S rDNA sequences alignment

YI Long1，2， LU Zhan-jun1，2， ZHONG Ba-lian2，LAI Xiao-hua2， CHEN Ci-xiang2

（1College of Life and Environmental Sciences， Gannan Normal University， Ganzhou，Jiangxi 341000 China； 2Jiangxi Navel Orange Engineering and Technology Research Center， Ganzhou，Jiangxi 341000 China）

Abstract: Seven Citrus Huanglongbing (HLB) bacteria of Gannan navel orange in Jiangxi Province were detected by PCR with primers specific to Asian， African and American liberibacters. The XbaⅠrestriction endonucleases were used to digest the HLB 16S rDNA fragment of Gannan navel orange， and the sequences of 16S rDNA were sequenced and compared with those corresponding sequences of Asian， African and American liberibacters from GenBank by BioEidt and MEGA software. The results showed that the HLB pathogen of Gannan navel orange could be detected by the specific primers of Candiatus L. asiaticus. RFLP analysis demonstrated that the digested XbaⅠprofiles of 16S rDNA of the HLB isolates from Gannan navel orange had similar profiles with Ca. L. asiaticus. The 16S rDNA sequences of the 7 HLB isolates have identity ranging from 99.8% to 100%， and 98.4% to 99.9% with Asian liberibacters were higher identity than those with African liberibacters or American liberibacters. The same results were found by analyzing the sequences average nucleotide distance of HLB isolates of Gannan navel orange， Asian， African and American liberibacters. Phylogenetic analysis revealed that the 7 HLB isolates of Gannan navel orange were located in different phylogenetic clusters with African and American liberibacters， and classified into one cluster with Asian liberibacters， and shared higher homology and closer relationships. The results indicated that the HLB isolates of Gannan navel orange were Ca L. asiaticus.

Key words: Gannan navel orange； Citrus Huanglongbing； 16S rDNA； RFLP analysis； Sequence alignment

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing， HLB）是柑橘产区毁灭性的病害，广泛分布于亚洲、非洲、美洲等柑橘主产区，由一种迄今尚不能人工培养的韧皮部限制性细菌（Candiatus Liberibacter）引起[1-2]。根据病原物的热敏感性、发生区域和虫媒类型，柑橘黄龙病病原存在亚洲种（Ca. L. asiaticus）、非洲种（Ca. L. africanus）[3]和美洲种（Ca. L. amercanus）[4]。受全球气候持续变暖的影响，黄龙病传播媒介柑橘木虱活动范围的扩大和患病苗木和果品不经检疫、无证调运导致该病目前存在不断扩增蔓延的趋势。江西赣南目前脐橙种植面积近11.3万hm2，已成为世界第一大脐橙集中产区，国内其他柑橘产区发生的黄龙病病菌菌系特征研究相对较多[5-6]，而针对赣南脐橙上携带的柑橘黄龙病病菌的研究尚未见报道。

利用16S rDNA可区分黄龙病病原种间的差别[3，7-8]，我们通过对赣南脐橙上具有代表性的7个柑橘黄龙病病原进行菌系类型检测，限制性内切酶XbaⅠ对其16S rDNA进行RFLP分析和测定的16S rDNA序列同GenBank登录的亚洲种、非洲种和美洲种的相应序列进行比对分析，明确赣南脐橙上HLB菌系类型和分子特征，对今后赣南脐橙上HLB的检测、防治以及进一步研究具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 供试样品

采自江西赣南脐橙上7个表现典型黄龙病症状的样品Gn-H1~Gn-H7，阳性和阴性对照样品由江西省脐橙工程技术研究中心提供。

1.2 总核酸提取及赣南脐橙HLB菌系类型检测

参照周常勇等[9]的方法提取总核酸。根据Jagoueix等[3]和Teixeira等[7]的方法，用柑橘黄龙病亚洲种和非洲种特异性引物OI1/OA1和OI2c，美洲种特异性引物GB1和GB3对上述样品进行扩增检测。引物由上海生工合成，序列OI1: 5’GCGCGTATGCA ATACGAGCGGCA3’， OA1: 5’GCGCGTATTTTATAC GAGCGGCA3’，OI2c: 5’GCCTCGCGACTTCGCAACC CAT3’，GB1: 5’CAAGTCGAGCGAGTACGCAAGTAC T3’，GB3: 5’CCAACTTAATGATGGCAAATATAG3’。PCR扩增体系: 10 × PCR缓冲液（含Mg2+）2.5 μL，2.5 μmol・L-1 dNTP 2.0 μL，引物（10 μmol・L-1）各1 μL，核酸模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，加Millorple水补足总体积25 μL，置于Bio-Rad PTC-200 PCR仪上按94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，64 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35循环；72 ℃ 10 min程序扩增。亚洲种和非洲种扩增片段约1 160 bp，美洲种扩增片段约1 027 bp，PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，在溴乙锭染色后，置于Gel Doc XR+TM System型凝胶成像系统（Bio-Rad）中观测并拍照。

1.3 赣南脐橙HLB病原16S rDNA扩增产物RFLP分析

按照Jagoueix等[3]的方法略作修改，取PCR产物10 μL，10 × Buffer 2 μL，0.1%BSA 2 μL，10 U・ μL-1 XbaI 酶1 μL，加Millorple水补足总体积至20 μL，混合均匀后于37 ℃下反应1 h。2.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.4 柑橘黄龙病原16S rDNA基因序列测定及分析

采用上海生工的胶回收试剂盒，对16S rDNA扩增产物进行纯化、回收，将纯化的片段连接到pMD18-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞获得靶片段的重组质粒DNA，选取阳性克隆菌株送交上海生工进行序列测定，所用测序仪器为ABI PRISM3730，测序试剂为BigDye terminator v3.1。

将测定的序列与GenBank登录的黄龙病菌亚洲种、非洲种、美洲种的16S rDNA序列经Bio Edit 7.0.1多重比对分析序列变异位点和序列同源性，用MEGA4.0软件以Kimura双参数模型计算序列间遗传距离，用邻近法（Neighbor-Joining）构建系统发育树进行进化分析[10]。

2 结果与分析

2.1 赣南脐橙上HLB菌系类型检测

赣南脐橙上7个具有典型症状的HLB代表性样品和阳性对照以特异性引物OI1/OI2c经PCR扩增，均扩增出大小约1 160 bp的目标产物，阴性对照不能检测到该扩增产物（图1）。而以OA1/OI2c和GB1/GB3引物对未扩增出目标片段。结果表明在分析的赣南脐橙样品上检测到HLB病菌亚洲种，而未检测到非洲种或美洲种。

2.2 赣南脐橙上HLB病原16S rDNA RFLP分析

通过对赣南脐橙上HLB病原16S rDNA PCR产物进行XbaⅠ酶切分析，所有的PCR产物均被酶切为大小分别640 bp和520 bp的2条片段（图2），相互之间无明显差异，与黄龙病病原亚洲种XbaⅠ酶切图谱相一致[5-6]。

2.3 赣南脐橙上HLB病原16S rDNA 序列分析

2.3.1赣南脐橙上HLB菌群与亚洲种、非洲种、美洲种间的序列同源性分析 测定的赣南脐橙上7个HLB菌株16S rDNA的1 167 bp序列经比对分析共有2个碱基位点发生变异，分别是Gn-H1和Gn-H5菌株在第47位点为G，而其他菌株为A；Gn-H6菌株在第1 030位点为C，其他菌株为T，整个比对的序列不存在碱基缺失和插入。

将测序结果与从GenBank数据库中下载的亚洲种: L22532（登录号）、EU921622和DQ431997 ~ DQ432005；非洲种: L22533、AF137368和EU921619 ~ EU921621；美洲种: AY742824、EU921623 ~ EU921625的16S rDNA序列进行相似性比对分析。从表1可见7个赣南脐橙上HLB 16S rDNA序列同源性为99.8％~100％，同GenBank收录的亚洲种同源性为98.4%~99.9%，非洲种同源性为94.2%~98.2%，美洲种同源性为94.0%~94.4%。序列同源性比对结果表明，赣南脐橙上HLB菌群与亚洲种的同源性最高，菌系类型最为相似。

2.3.2 赣南脐橙上HLB菌群与亚洲种、非洲种、美洲种间核酸遗传距离 在分析的4个HLB菌群中16S rDNA序列的遗传距离由表2可见，赣南脐橙HLB菌群与亚洲种间的核酸遗传距离为0.004，远小于其与非洲种间的核酸遗传距离0.020。以及与美洲种间的核酸遗传距离0.041，表明赣南脐橙HLB菌群与亚洲种间亲缘关系更为接近。

2.3.3 16S rDNA 序列的系统发育树构建 采用邻近法对7个赣南脐橙上的HLB菌株和比对分析的亚洲种、非洲种、美洲种菌株构建系统发育树。图3可见，分析的菌株被分成3个类群，由赣南脐橙上HLB菌群和亚洲菌株聚类为第1组群（分支受98％的自展值支持）；非洲种菌株聚类为第2组群（分支受98％的自展值支持）；美洲种菌株聚类为第3组群（分支受100％的自展值支持）。赣南脐橙上7个黄龙病病原与亚洲种聚类在同一分支上，而与非洲种、美洲种在不同的分支上，且遗传距离较远，表明赣南脐橙HLB菌与亚洲种归为一类，归属亚洲种。从聚类的第1组群分析可见赣南脐橙上7个HLB菌株在聚类树上并未完全聚类在一起，而是与其他亚洲株系分散聚类在更小的分支上，如菌株Gn-H1和Gn-H5及DQ432003菌株聚类为一支，有63%的自展值支持，并未同其他5个赣南脐橙HLB菌株紧密的聚类在一簇上，暗示在赣南脐橙上HLB菌株彼此间有一定的差异，但并不明显，菌株间是否存在种内分化，还需进一步分析确认。

3 讨 论

柑橘黄龙病严重危害柑橘产业的健康发展，能侵染各种柑橘类植物，造成植株经济寿命减短、产量降低、果品劣质失去经济价值。近期的研究表明柑橘黄龙病菌具有区域遗传多样性，即在不同地理区域的菌系具有一定的遗传多样性，即使在某一特定地区也有一定的差异[11]。而赣南作为全世界最大的脐橙生产区，其黄龙病病菌的菌系类型、分子特征至今不详。

在本研究中，对采自赣南脐橙产区的7个典型代表性样品进行了特异性引物亚洲种、非洲种和美洲种的检测，结果表明7个样品均能被亚洲种特异性引物扩增检测到，而不能被非洲种或美洲种特异性引物检测到；XbaⅠ酶切菌株16S rDNA表明7个赣南脐橙上的HLB菌株产生的酶切图谱与亚洲株系产生的酶切图谱结果相一致，结合测定的16S rDNA序列分析，赣南脐橙上的HLB菌群与亚洲种间序列同源性在98.4%以上，高于与非洲种和美洲种间的序列同源性；核酸遗传距离分析同样表明赣南脐橙上HLB菌群与亚洲种间的核酸遗传距离最小，而与非洲种和美洲种间的核酸遗传距离较大，表明其与亚洲种的亲缘关系更为接近；构建的系统发育树分析表明，赣南脐橙上HLB菌株与亚洲株系聚类在一簇，而与非洲株系和美洲株系分属不同的组群，说明赣南脐橙上HLB菌株与亚洲种更为接近，具有较高的亲缘关系。结合特异性引物检测结果、酶切图谱、序列同源性、核酸遗传距离及系统发育树分析，表明赣南脐橙上HLB菌系为亚洲种，同时也明确其菌系的检测特异性引物及其菌株的分子特征，为今后在赣南脐橙黄龙病的快速准确的检测检疫、无病毒苗木鉴定、科学有效的防控措施制定上具有重要的指导意义，同时为今后深入开展赣南脐橙黄龙病病菌的系统研究奠定了一定的基础。

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