攀枝花余甘子多糖的提取研究

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摘要：运用正交设计，以料液比、提取温度和提取时间为因素，考查３个因素对提取攀枝花地区野生余甘子果实多糖的影响。最佳工艺条件为，料液比为１∶２０（ｍ∶ｍ，下同），提取温度为１００ ℃，提取时间为３．０ ｈ，余甘子多糖的含量为５．９１％。

关键词：多糖；余甘子；正交设计

中图分类号：Ｒ２８２．７；Ｏ６２９．１２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）12－2523-03

Study on Polysaccharide Extraction from Phyllanthus emblica in Panzhihua

ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ１ａ，1ｂ，ＬＩ Ｍｉｎ－ｊｉｅ１ａ，1ｂ，ＹＡＮＧ Ｇｅ2

（１.Ｐａｎｚｈｉｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｂ． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｐａｎｚｈｉｈｕａ６１７０００， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ， Ｐａｎｚｈｉｈｕａ６１７０００，Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｆｒｕｉｔ ｉｎ Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ Ｌ． ｉｎ Ｐａｎｚｈｉｈｕａ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｌｉｑｕｉｄ ｒａｔｉｏ， １∶２０（m∶m）； ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｉｍｅ， ３.0 ｈ； ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， １００ ℃． Ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ５．９１％ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ Ｌ．； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ

余甘子（Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ ｅｍｂｌｉｃａ Ｌ．）即滇橄榄（大戟科Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ，叶下珠属Ｐｈｙｌｌａｎｔｈｕｓ），是一种十分独特的生长在中国亚热带、热带部分地区，特别是干热河谷地区的落叶乔木或灌木资源植物［１］。余甘子是药食两用的具有保健功能的经济资源植物，果实在我国作为中药，包括藏医药等民族药用植物记载使用已有２ ０００年历史［２］。全世界有将近２０多个国家或民族在自己的传统药物体系中使用余甘子，这与其有多种治疗功效有关，其主要用作轻泻剂、抗病毒、抗细菌和真菌、抗氧剂、利尿剂，用于口腔疾病、糖尿病、腹泄、发烧、发炎等多种病症的治疗。药理研究结果也表明，余甘子具有抗微生物感染、抗氧化、抗肿瘤、降血脂和血糖、降压、补益等多种生物活性，且无明显的毒副作用［３］。

目前国内对余甘子药用成分的研究主要集中在余甘子没食子酸、挥发油、槲皮素、游离氨基酸、多酚类物质、超氧化物歧化酶等方面［４，５］，对余甘子多糖的研究还比较少见。余甘子多糖作为余甘子的主要组分之一，其提取工艺和生理活性的研究必将会给人类对抗疾病困扰带来新的有力武器。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１植物材料样品采自攀枝花市仁和区，采取野生余甘子新鲜果实。取颗粒大小、饱满程度、色泽都较均匀的果实洗净，６０ ℃烘干，粉碎后经１００目筛过筛，得干粉备用。

１．１．２试剂石油醚、无水乙醇、苯酚、无水葡萄糖、乙醚、浓硫酸，均为分析纯，均产自成都市科龙化工试剂厂。

１．１．３仪器ＡＰ－０２真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；ＨＲ／０６／ＢＣ搅拌机（珠海飞利浦家庭电器有限公司）；７２２可见光分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；ＹＰ２０２Ｎ电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；８００２ ＴＤＡ温度控制仪（北京市永光明医疗仪器厂）；２０２－２ＡＢ电热恒温干燥箱（北京中兴伟业仪器有限公司）；索氏回流器等。

１．２方法

１．２．１葡萄糖标准液的配制准确称取１０５ ℃干燥至恒重的无水葡萄糖１００ ｍｇ，用去离子水定容至１００ ｍＬ，再取该溶液１０ ｍＬ用去离子水定容至１００ ｍＬ，即得１００ μｇ／ｍＬ的葡萄糖标准液。用吸量管准确移取苯酚５ｍＬ，去离子水定容至１００ｍＬ，即得５％苯酚液，棕色瓶中避光保存。取８支洁净试管，分别精密量取０．０、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ ｍＬ葡萄糖溶液，加去离子水至２ ｍＬ，再分别加入５％苯酚液１ ｍＬ，摇匀后迅速加入５ ｍＬ浓硫酸，摇匀放置５ ｍｉｎ，置沸水浴中加热１５ ｍｉｎ取出冰浴冷却至室温，以空白试液为对照，在最大吸收波长即４９０ ｎｍ处测定吸光度（Ａ）。以吸光度（Ａ）为纵坐标，葡萄糖浓度（Ｃ）为横坐标绘制标准曲线，并求回归方程。

１．２．２石油醚去脂称取余甘子果实干粉１０ ｇ，置于索氏回流器中，经石油醚（３０～６０ ℃）２５０ ｍＬ回流抽提脱脂１次，时长１．０ ｈ。

１．２．３温水浸提将余甘子干粉置于５００ ｍＬ烧杯中，按设定料液比加水并在烧杯口加盖三分之二玻璃片，防止水分过量蒸发，置于ＴＤＡ温度控制仪中，在设定温度水浴浸提数小时，提取两次。

１．２．４过滤沉淀将提取液进行抽滤，弃去滤渣。按１∶４（滤液∶无水乙醇）体积比［６］加入无水乙醇于滤液，静置２４ ｈ［７］后抽滤，弃去滤液，滤渣用药匙刮至培养皿中。将培养皿置于电热恒温干燥箱中，６０ ℃恒温干燥，得黄白色粉末，即得余甘子多糖粗品。

１．２．５粗多糖的多糖含量测定精密称取干燥至恒重的粗余甘子多糖１００ ｍｇ，用去离子水高温溶解后冷却至室温，稀释定容至１００ ｍＬ，再取１０ ｍＬ该溶液稀释定容至１００ ｍＬ，即配制成了１∶１ ０００的粗多糖溶液。用吸量管精密吸取该溶液２ ｍＬ于试管中以标准曲线绘制项操作，于４９０ ｎｍ波长处测定其吸光度并带入回归方程计算多糖含量。样品中的多糖含量＝（Ｃ×Ｖ×Ｄ×１０－６）／（２×Ｗ粗）×１００％，其中，Ｃ――吸光度测定的溶液中多糖浓度（μｇ／ｍＬ），Ｖ――待测液体积（ｍＬ），Ｄ――稀释倍数，Ｗ粗――称取的粗多糖质量（ｇ）。

２结果与分析

２．１标准曲线绘制

取吸光度（Ａ）对葡萄糖液浓度（Ｃ）进行线性回归，得回归方程及标准曲线（图１）。

２．２单因素试验

２．２．１料液比对多糖含量的影响精密称取余甘子干粉１０ ｇ，分别采用１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０的料液比，提取温度９０℃，提取时间２．０ ｈ。研究料液比对余甘子多糖提取的影响，共做３组平行试验。由图２可知，在提取温度和提取时间相同的条件下，料液比从１∶１５变为１∶２０的过程中，多糖含量上升，１∶２０时含量最高，达到了５．０７％。

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２．２．２提取时间对多糖含量的影响精密称取余甘子干粉１０ ｇ，采用１∶２０的料液比，提取温度９０℃，提取时间分别为１．０、２．０、３．０、４．０ ｈ，研究提取时间对余甘子多糖提取的影响，共做３组平行试验。在提取温度和料液比相同的条件下，提取时间从１．０ ｈ上升到３．０ ｈ的过程中，多糖含量也随之上升，在提取时间为３．０ ｈ时含量达到最大，为５．５３％。之后，提取时间再增加，多糖含量反而下降。

２．２．３提取温度对多糖含量的影响精密称取余甘子干粉１０ ｇ，采用１∶２０的料液比，提取温度分别为７０、８０、９０、１００ ℃，提取时间２．０ ｈ，研究提取温度对余甘子多糖提取的影响，共做３组平行试验。在提取温度从７０ ℃上升到９０ ℃的过程中，多糖含量也在逐步上升，并且在９０ ℃时含量达到最大，为５．３２％。在此提取温度基础上，若再增加温度，多糖含量则下降。

２．３正交试验

２．３．１正交设计单因素试验结果表明，在其余两因素条件相同，料液比为１∶２０，提取时间为３．０ ｈ，提取温度为９０ ℃时多糖含量最高。因此选取料液比、提取时间和提取温度作为考察因素，每因素拟定３个水平，运用Ｌ９（３４）正交表（表１），确定余甘子多糖的最佳提取工艺。多糖含量结果见表２。

由正交结果极差分析可知，３个因素对余甘子多糖的影响效果分别为：料液比＞提取温度＞提取时间。

ＳＰＳＳ１３．０方差分析表显示，料液比的Ｐ值为０．０２４，料液比不同水平对多糖含量的影响显著。由均值比较，料液比１∶２０条件下提取结果较好。料液比太低会使提取溶液黏度太高，原料粉与水难以充分混合，不利于多糖溶出，得到的多糖含量不高。料液比太高会使提取液中多糖浓度降低，而且会增加后续工艺中的提取液的浓缩度和醇沉中的酒精用量，浪费工艺成本。提取温度的Ｐ值为０．０３７，说明不同水平对多糖含量影响显著。由均值可得出，１００ ℃条件下的多糖提取结果较好。过高的提取温度会破坏多糖结构、使有些多糖发生降解而影响其生物活性，而且在实际生产中，过高的温度会增加能耗和成本的投入。提取时间的方差分析Ｐ值为０．０７３，对多糖含量影响不显著。提取时间太短不利于多糖的溶出，从而降低多糖提取得率。提取时间太长会使多糖在高温提取过程中的时间过长，而使部分多糖破坏和降解，降低多糖的得率。综合试验结果并考虑实际应用成本等因素，确定最佳提取工艺条件为余甘子果实干粉脱脂后，以２０倍加水量提取两次，每次３．０ ｈ，提取温度１００ ℃。

２．３．2工艺验证按照正交试验所确定的优选工艺条件，进行验证试验５次，结果见表４。试验测定多糖平均含量为５．９１％，ＣＶ为０．６７％，结果表明该提取工艺稳定可行。

３讨论

通过试验探索了用“水提醇沉法”提取余甘子多糖的最佳工艺条件，考察了料液比、提取时间和提取温度对水提法提取余甘子多糖时得率的影响。并在单因素试验基础上进行了三因素三水平正交试验，以确定最佳的提取条件。试验结果表明，料液比和提取温度对多糖含量的影响显著，提取时间对多糖含量的影响不显著。水提醇沉法提取余甘子多糖的最佳条件为，料液比为１∶２０，１００ ℃下提取３．０ ｈ，多糖含量为５．９１％。

相比酶提法、超声法和超临界萃取法等，醇沉水提法提取效果稍差。但考虑实际成本和某些负效应，如酶法降解副产物对提取会有影响，超声波的凝聚作用以及热点作用下多糖的降解问题等［８，９］，本课题虽采用了较传统和保守的水提法，但是根据所得的试验结果来看，多糖含量较高，提取效果比较理想。

试验旨在为余甘子果酒制作提供一定的参考数据，未涉及余甘子植株其他部位多糖含量的研究。已有研究表明，余甘子植株除了果实以外的其他部分如根、叶、芽、种子、茎等也含有相当高的多糖含量。在某些品种余甘子植株中，果实以外的多糖含量甚至高于果实本身［１０］。

余甘子属于攀西干热河谷地区的特色植物资源，入药食用皆宜。目前攀西地区的余甘子多糖提取研究未见相关报道，研究成果具有一定的参考意义。余甘子多糖提取的影响因素复杂，包括料液比、提取时间、提取温度、提取次数、醇沉浓度、醇沉时间等，本研究仅取前３个常见因素作正交优选。今后有必要进一步就原料和工艺两方面比较余甘子植株其他器官的多糖含量和提取工艺中的其他因素的影响效果。

参考文献：

［１］ 班晋． 余甘子的经济价值及其发展前景分析［Ｊ］． 广西热带农业，２００８（２）：４７－４９．

［２］ 陈知毅，刘学铭，吴继军． 余甘子的药理研究和利用综述［Ｊ］． 中国南方果树，２００４，３３（１）：５８－６１．

［３］ 朱艳娟．余甘子的研究进展［Ｊ］．中华实用中西医杂志，２００７，２０（７）：６２２－６２３．

［４］ 杨顺楷，杨亚力，杨维力． 余甘子资源植物的研究与开发进展［Ｊ］． 应用与环境生物学报，２００８，１４（６）：８４６－８５３．

［５］ 赖志勇，戴宏芬，肖维强，等． ４种余甘子功能成分的分析［Ｊ］． 华中农业大学学报，２００９，２８（１）：９７－１０１．

［６］ 陈奎，陈宜斌． 板蓝根多糖提取和纯化工艺研究［Ｊ］． 食品研究与开发，２００７，２８（４）：５７－５９．

［７］ 王新琪，蔡广之，韩梅，等． 冬瓜皮多糖提取工艺研究［Ｊ］． 吉林农业大学学报，２０１０，３２（１）：５４－５７，６１．

［８］ 齐香君．现代生物制药工艺学［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００３． １８０－１８２．

［９］ 高续春．多糖提取纯化方法研究进展［Ｊ］． 榆林学院学报，２００９，

１９（４）：６５－６７．

［１０］ 蔡英卿，赖钟雄，何夏森，等． 余甘子各器官多糖含量分析［Ｊ］． 中国农学通报，２００７，２３（３）：４２８－４３３．

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