酶抑制剂筛选的研究进展

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇酶抑制剂筛选的研究进展范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

中图分类号：R97 文献标识码：A 文章编号：1006-1533(2007)03-0117-03

20世纪60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念,从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域。酶抑制剂新药发现的途径：一是来源于天然化合物，包括动植物和各种微生物等，二是化学合成物。在目前上市的药物中，以受体为作用靶点的药物占52%，以酶为靶点的药物占22%，以离子通道为靶点的药物占6%，以核酸为靶点的药物占3%。因此，酶抑制剂的开发是新药来源的一个主要途径。以酶为靶点开发新药存在巨大潜力，今后很长一段时间仍然是发现新药的重要着手点。

1 我国酶抑制剂筛选的进展

我国对酶抑制剂的研究起步较晚，始于20世纪70年代末，但是我国进行有计划、有规模的筛选还不到10年，以前的工作没有成规模的化学合成作基础，筛选分散，随机性大。只有最近一些年来，随着高通量筛选和组合化学及组合生物合成技术的结合，规模化筛选药物得到了极大的发展，国内许多单位相继开展了酶抑制剂的筛选工作，福建省微生物研究所、上海医药工业研究院、中国医学科学院医药生物技术研究所、四川抗生素研究所等对酶抑制剂进行了大量研究。国内最为显著的是对血脂调节剂HMG-CoA还原酶抑制剂的研究。高通量筛选技术的发展，是我国筛选酶抑制新药的重大突破，1998年，中国医学科学院药物研究所引进了国内第一台微量闪烁计数器（microplate scintillation & lurminescense counter）对96孔板进行快速的放射性活性测定，使放射免疫实验及放射配基实验自动化、微量化，实现了从整体动物模型向高通量筛选模型的转化，为酶抑制剂的大规模筛选奠定了基础。目前，国内利用高通量筛选每周可筛选数万个化合物。

2 酶抑制剂源

目前，酶抑制剂主要来源于植物、微生物和化学合成。微生物产生酶抑制剂是来源于微生物的初级代谢产物和次级代谢产物，研究最多的是放线菌，也是产生微生物药物最多的类群，其中最重要的是链霉菌属（streptomyces）；细菌、真菌也是酶抑制剂的重要药源微生物。除了传统的药源菌筛选分离外，研究人员的注意力更集中到了各种新的微生物类群中，如海洋微生物、极端微生物［1］。自然界植物种类丰富，但仅有不到10%被测定过某种生物活性，从植物中筛选酶抑制剂存在巨大的潜力，在未来相当长时间内仍是酶抑制剂新药的主要来源。植物源酶抑制剂筛选的难点就在于植物粗提物中“假阳性”结果太多，干扰真正有效成分的筛选，目前，国外对此采取了一系列措施，筛选前先通过纯化，采用提取物通过HPLC或固相萃取后结合质谱作出化合物指纹图谱库，与已有的经验数据库进行比较，有新成分的粗提物再进一步进行药理活性筛选, 再者，他们还可以先将粗提物通过HPLC来鉴别出是否存在吸收光谱有特征的化合物，这样可以减少筛选的盲目性［2］。新药筛选的化合物库中有70%左右为有机化学产物，因此，合成药是新药的主要来源，将高通量筛选技术与组合化学和组合生物合成技术的结合，实现了酶抑制剂大规模筛选，是世界许多大制药公司筛选酶抑制剂新药的主要渠道。

3 筛选模型

酶抑制剂的筛选模型分为三类：整体动物水平模型、组织器官水平模型和细胞分子水平模型。整体动物模型通常效率低、耗费多，筛选的样品量多而筛选出的化合物却很少，并不适合作为药物初筛的模型。而组织器官模型是药物筛选的一大进步，它在一定程度上克服了整体动物模型的不足，减少了筛选样品量，降低了劳动强度，扩大了筛选规模，减少了动物用量，提高了筛选效率，降低了筛选成本，但是尽管这样，还是存在规模小、效率低、样品量较大等缺点，不易实现一药多筛。随着酶和受体作为靶分子的阐明及分子生物学和细胞生物学技术的发展，分子药理学的不断深入，细胞分子水平药物筛选模型应运而生，此模型克服了前两者的缺点，实现了大样本量的筛选和一药多筛，已成为目前药物筛选的主要方法，使传统的手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，从而产生了高通量筛选［3,4］。高通量筛选始于20世纪80年代后期，在20世纪90年代后期得到极大发展，已成为酶抑制剂新药发现的主要手段，筛选快速、高效，其筛选的过程为： 粗筛复筛深入筛选确证筛选。其先进的检测方法使每周筛选数万个化合物成为可能，对酶抑制剂的筛选大多数情况测定酶活性即可检测，其检测方法主要为：放射免疫检测（RIA）、荧光检测（FA）、闪烁接近检测（SPA）、比色法检测等。Flotow通过放射法已成功建立了P56kk激酶抑制剂的高通量筛选模型。Taft等［5］也利用此法建立了（1.3）β-葡萄糖合酶抑制剂的高通量筛选方法。基于放射性的闪烁接近检测（SPA）技术已成功应用于激酶抑制剂、肝炎C病毒（HCV）NS3蛋白酶抑制剂等的药物筛选。用荧光检测法筛选逆转录酶抑制剂、HIV-1蛋白酶抑制剂、中性内肽酶抑制剂等均获成功。利用比色法已成功筛选出了脂氧合酶抑制剂，次黄嘌呤核苷-5’-单磷酸脱氢酶抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、蛋白酪氨酸激酶抑制剂等［5～7］。

由于很多因素会影响与酶靶点作用的化合物的药理作用，在体外对靶分子或细胞作用较强的物质在生物体内可能会被迅速降解或通过旁路途径功能的调整而降低或消除活性成分的作用,许多在体外作用强度较高的酶抑制活性成分在生物体内往往显示不出理想的作用效果,仅仅依靠分子水平模型的结果全面认识化合物的药理作用还有一定距离。因此，通过高通量筛选的药物必须通过动物模型进行复筛。

4 筛选方法

酶抑制剂筛选的方法主要分为体内和体外筛选，体内筛选即利用动物进行筛选，体外筛选包括体外试管筛选和体外细胞筛选，以下介绍几种酶抑制剂的筛选方法。

4.1 HMG-CoA还原酶抑制剂的筛选

HMG-CoA还原酶是合成胆固醇过程的限速酶，抑制其活性即可抑制胆固醇的合成，从而起降血脂作用。其筛选方法为：（1）固醇脂质合成的同位素掺入法［8］。用鼠肝微粒体或胞浆酶作为粗酶制剂，在反应体系中加入同位素标记的合成前体如［14C］-乙酸或D，L-［14C］HMG-CoA，或D，L［14C］-甲羟戊酸作为底物，反应后测定形成的固醇中同位素的掺入率，样品抑制固醇脂质合成能力可以通过与对照组数据对比求得。（2）利用对某些真菌的抑制活性及其用加酶催化产物抵消试验来筛选。(3)应用酶联免疫吸附测定法将已知的 β-羟-β -甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂compactin与蛋白质交联，其交联物免疫动物获得抗体。酶标抗体作为探针在发酵液中定向寻找目标物。采用双抗体法进行筛选［9］。（4）动物实验。用于进一步的活性测定，方法是从大鼠尾静脉注射tritonWR-1339盐水溶液，注射后立即停止喂食，并持续使其处于饥饿状态，被检测的大鼠在注射triton后分几次给药，在注射triton 24 h后取肝和血浆测总胆固醇和甘油酯，评价样品降血脂的效果［8］。

4.2 法呢基转移酶抑制剂的筛选

法呢基转移酶（farnesyltransferase,FTase）是Ras蛋白脂类共价修饰过程中最关键的酶, 寻找FTase抑制剂已成为近年来抗癌药物研究领域的热点之一。FTase抑制剂一方面来自对天然产物的筛选，另一方面来自人工合成。已有的筛选方法建立在三个水平上：无细胞水平、细胞水平和体内水平。（1）无细胞水平的筛选。即直接用纯化的FTase在人工反应体系中测定化合物对它活性的抑制作用。FTase活性测定方法有多种，最常用的一种是测定［3H］法呢基从［3H］FPP转到Ras蛋白的数量。一个酶活力单位定义为：1 h内在标准反应条件下(37 ℃ ，pH 7.4)把l pmol法呢基转移到Ras蛋白上去的酶量。这种方法的关键是要能够完全分离标记的反应产物，分离的方法主要有：凝胶电泳法、过滤法、免疫沉淀法。（2）细胞水平的筛选。目前人们已采用各种细胞模型包括GPAL酵母突变株、Ras细胞、HeLa细胞、蛙卵母细胞及人肿瘤细胞等。其中GPAL酵母突变株应用较广，手霉素(manumycin)族抗生素类的三种抑制剂UCF-A、UCF-B、UCF-C就是用这种方法从链霉菌属中筛选出来的；利用Ras细胞筛选是以抑制Ras转化细胞的停泊非依赖性生长和单层培养生长作为合适指标；HeLa细胞模型是通过检测FTase抑制剂引起前核纤层蛋白A在HeLa细胞中积累的数量，来评价抑制剂的活性。（3）体内水平筛选。可利用线虫、裸鼠等进行筛选，利用线虫筛选FTase抑制剂可以通过抑制法呢基化抑制Let-60 Ras蛋白功能，从而抑制发生了gf突变的C. elegans幼虫Muv表型的发生，并且具有剂量依赖关系，可以用来评价FTase抑制剂的活性, 不过线虫的结构和生理功能毕竟远不及哺乳动物复杂，因此这个模型的实用意义还有待于进一步研究。

4．3 醛糖还原酶抑制剂的筛选

醛糖还原酶（AR）是多元醇通路中的关键限速酶，抑制它的活性能减少山梨醇在细胞内的堆积，防止一系列糖尿病并发症的发生，因此，筛选醛糖还原酶抑制剂是糖尿病新药来源的重要途径。其筛选也分为体外筛选和体内筛选：（1）体外筛选。目前醛糖还原酶抑制剂的体外筛选主要利用高通量筛选，即直接用纯化的AR在人工反应体系中测定化合物对AR活性的抑制作用。其筛选方法为：以DL-甘油醛为底物，还原型辅酶Ⅱ（NADPH）为辅酶，建立ARIS的高通量筛选模型，杨［10］，彭剑等人［11］应用96孔石英板，建立了AR的微量高通量筛选模型，一个酶活单位定义为：反应体系在37 ℃，pH 6.2下，在340 nm处吸光度每分钟下降0.001为一个单位，以不含底物的样品为空白对照，测试样品对AR的抑制活性，AR粗酶抑制率按以下公式计算：I = （ΔA对照-ΔA样品）/（ΔA对照-ΔA空白）。（2）体内筛选。主要采用动物模型向动物给药，提取分离血浆中的红细胞，体外测定红细胞中AR的活性。目前测定红细胞中AR活性的方法有：柱层析法、荧光法和ELISA［12～14］。

5 酶抑制剂产品

目前，已上市的酶抑制剂药种类很多，针对各种疾病筛选出的酶抑制剂新药源源不断地进入市场。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）是治疗心血管疾病的一类重要药物，最早上市的血管紧张素酶抑制剂是卡托普利，以后陆续上市了伊那普利、赖诺普利、西拉普利、雷米普利、培哚普利、福辛普利等。α-葡萄糖苷酶抑制剂能降低进食后血糖上升及血清胰岛素的增加，1995年上市的阿卡波糖和1997年上市的伏格列波糖被列为治疗糖尿病药。此外米格列醇也是一种α-葡萄糖苷酶抑制剂。针对糖尿病并发症，醛糖还原酶（AR）抑制剂托瑞司他和依帕司他在欧洲和日本已上市 。羟甲戊二酰辅酶A（HMG-CoA）抑制剂是一类降血脂药，目前上市的HMG-CoA抑制剂有洛伐他丁、西伐他丁、普伐他丁、氟伐他丁、阿伐他丁和辛伐他丁。抗肿瘤方面，包括TOPOⅠ抑制剂拓扑替康和伊立替康等，TOPOⅡ抑制剂甲柔红霉素、吡喃阿霉素及鬼臼噻吩苷等。蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑制剂，有三羟异黄酮等。抗HIV方面，已上市的蛋白酶抑制剂药包括：沙奎那韦(saquinavir) 、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)、茚地那韦(indinavir)和洛匹那韦(1opinavir)。此外，还有增加青霉素抗耐药菌能力的β-内酰氨酶抑制剂：棒酸、青霉烷砜等；解热镇痛抗炎的环氧合酶抑制剂：阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、布洛芬等；抗痛风的黄嘌呤氧化酶抑制剂：别嘌呤等酶抑制剂。

6 结语

我国天然资源丰富，但是被利用的却不多，天然来源的酶抑制剂存在很大的潜力，有待进一步开发；而组合化学和组合生物合成技术为合成酶抑制剂筛选打下了坚实的基础，它们是合成药发展的不懈动力。药物筛选模型是发现酶抑制剂新药的重要条件，新模型的建立必将带来新型药物的出现，分子生物学、细胞生物学、计算机科学的发展为建立新的药物筛选模型提供了重要条件，有理由相信，随着酶靶点的扩展和高通量筛选技术的应用，会有更多、更有效的酶抑制剂被发现。

本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。