成骨细胞茜素红染色方法改进
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摘要 目的：优化茜素红染色方法，应用于干细胞成骨分化检测。方法：干细胞成骨诱导分化后，以70%乙醇进行细胞固定，以pH值为8.3的PBS和Tris-HCl以及pH值为4.2的PBS和Tris-HCl配制茜素红溶液，进行成骨细胞染色。结果：不论是PBS还是Tris-HCl，pH值为8.3的较难染色，而pH值为4.2则可成功染色。结论：茜素红溶液的pH值调整为4.2有利于成骨细胞染色。
关键词 成骨细胞；固定液；茜素红溶液；pH值
中图分类号 R153 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-（2012）122-0174-01
成骨分化是干细胞的一个重要特性。在特定的诱导培养基作用一段时间后，干细胞可分化为成骨细胞，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。应用茜素红溶液对成骨细胞染色，茜素红可与钙离子螯合，产生红色或紫红色的复合物，可用于鉴定干细胞是否已成功向成骨细胞分化。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
5～7月龄的新西兰大白兔由苏州大学南校区动物房获得。
DMEM-LG培养基、胎牛血清FBS、青-链霉素，购自Hyclone公司。
胰酶，购自Gibco公司。
成骨分化试剂，包括地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸磷酸盐，茜素红，均购自Sigma-Aldrich公司。
1.2 兔骨髓间充质干细胞的提取
从5～7月龄的新西兰大白兔中取出股骨和胫骨，放入含100 U/ml青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM-LG培养基中。在超净台中，将骨表面组织剃除干净，以PBS冲洗。将骨骺最外端切开，以培养基将骨髓冲洗出来。骨髓液以1000 rpm离心，计数后以含10%胎牛血清和100 U/ml 青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM-LG培养基重悬细胞沉淀，接种在培养皿中，在37℃、5% CO2的条件下培养。每2天换一次液。细胞在原代和传代培养后贴壁生长。红细胞和其他未贴壁的细胞则在换液时被移除2。
1.3 成骨诱导分化
将第2代骨髓间充质干细胞以2×104 cells/cm2密度接种于24孔板内，以基础培养基（DMEM-LG培养基，含10%胎牛血清和100 U/ml青霉素、100 μg/mL链霉素）进行培养。待细胞长至约80%时，以成骨诱导分化培养基（基础培养基，添加0.1 μM地塞米松、0.2 mM抗坏血酸磷酸盐和10 mM β-甘油磷酸钠）进行诱导，诱导时间为21天。
1.4 配制茜素红染色液
分别以PBS或Tris-HCl配制0.1%茜素红溶液，其pH值均调为8.3或4.2。
1.5 茜素红染色
诱导结束后，以70%乙醇固定细胞1 h，以双蒸水洗3次后，茜素红溶液染色30 min。染色后以双蒸水洗3遍后，置于显微镜下观察。
2 结果
2.1 pH值为8.3的PBS溶液配制的茜素红无法成功染色
将固定好的细胞以pH值为8.3的PBS溶液配制的茜素红染色30 min后观察，肉眼下看，细胞层几乎无色。置于显微镜下观察，细胞表面呈淡淡的粉色，并非明显的红色或紫红色。将染色时间延长至1 h或染色过夜，结果仍然显示未成功染色。
2.2 pH值为8.3的Tris-HCl溶液配制的茜素红无法成功染色
操作同2.1。结果同样显示，不论染色时间多久，细胞仍然呈现较浅的颜色，未染色成功。
2.3 pH值为4.2的茜素红溶液可成功染色
细胞固定后以pH值为4.2的茜素红溶液染色，结果表明，不论是以PBS或Tris-HCl为溶剂，在30 min内，茜素菜红溶液可成功将诱导的成骨细胞染色。细胞在肉眼观察下即可发现呈明显的紫红色，在显微镜下可看见明显的紫红色钙结节，细胞亦被染成紫红色。
3 讨论
以茜素红溶液染色是鉴定间充质干细胞向成骨细胞分化的一个重要方法。间充质干细胞在成骨分化的过程中，在细胞表面沉积钙盐，形成钙结节。茜素红与钙离子螯合可形成紫红色或红色复合物。而在正常培养条件下，钙盐作为难溶盐，不以钙离子存在。故在茜素红溶液pH值为8.3的条件下，钙结节无法被染色。而当茜素红溶液pH值被调节为4.2时，钙盐可解离出大量钙离子，从而与茜素红螯合形成复合物，可在显微镜下检测出。因此，茜素红溶液的pH值对于成骨细胞的成功染色至关重要。
参考文献
[1]Zhang J， Wang JH. Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes. BMC Musculoskelet Disord 2010；11：10.
[2]何志义，原丽英，陈晏，赵晶，邹巧治，高卓，欧阳嶷.大鼠骨髓基质细胞的体外分离、培养和鉴定的实验研究[J].中国医科大学学报，2004，33（5）：395-396.
作者简介
过倩萍（1985―），女，江西上饶人，硕士研究生，实验技术员，苏州大学骨科研究所，研究方向：干细胞与组织工程方向。