用两种方法测定食品添加剂―DHA的含量比较
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摘要：本文采用了两种方法-气相色谱外标法和内标法测定DHA的含量并进行比较，同时对两种方法进行了加标实验，回收率和精密度均获得了预期的结果，证明了外标法的可行性。
关键词：外标法 内标法 DHA.
二十二碳六烯酸即DHA，就是我们俗称的脑黄金，是一种对我们人体极其重要的多不饱和脂肪酸，属于ω-3系列不饱和脂肪酸家族中的重要一员[1～3]。流行病学调查、动物实验和临床试验都已经证实了DHA具有降血脂、降血压以及抑制血栓形成等具有良好的疗效作用，是预防和治疗心血管疾病的理想的功能食品[4]；尤为重要的是DHA对中枢神经系统具有生理作用，它是脑组织及视网膜的重要构成成分，进而促进胎儿及婴幼儿大脑及视力的正常发育，从而起到延缓脑功能衰退及维持正常视力的作用[5～7]；另外，通过大量的研究也发现DHA在调节免疫系统、抗癌、抗炎症等方面具有积极疗效作用[8～9]；最为引人瞩目的是许多发达国家已经将DHA应用到孕妇、哺乳期妇女及婴幼儿的配方食品中，我国也从2000年以来也开始将DHA作为营养强化剂应用于婴幼儿以及学龄前儿童的配方食品中，并制定了相关的标准[10]。
目前作为食品添加剂的二十二碳六烯酸油脂（dha）的含量检测方法是GB 26400-2011中所采用的内标法。由于DHA酯在自然界中主要以DHA甘油三酯的形式存在，而本文中所采用的标准品为DHA甲酯和十三碳烷酸甘油三酯，所以样品中的甘油三酯均要经过甲酯化转化为甲酯和内标法中的内标物十三碳烷酸甘油三酯也要经过甲酯化转化为甲酯，才能用内标法（图1）（十三碳烷酸甲酯出峰时间：11.7min，DHA甲酯出峰时间：20.6min）和外标法（图2）（DHA甲酯出峰时间：20.6min）进行定量。本文将采用外标法和GB 26400-2011中内标法[11]两种方法进行比较，以期来证明外标法的可行性。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
气相色谱仪（附氢火焰离子化检测器（FID））：GC-2010型，日本岛津公司；
旋涡混合器：XW-80A型，上海沪西分析仪器有限公司；
台式高速离心机：TG16G型，湖南凯达科学仪器有限公司；
电子分析天平：AEY-210型，湘仪天平仪器设备有限公司；
电子天平：AUW120D型，日本岛津制作所；
正己烷：分析纯（质量分数为98.0%），湖南汇虹试剂有限公司；
氢氧化钾：分析纯（质量分数为98.0%），湖南汇虹试剂有限公司；
无水甲醇：色谱纯（质量分数为99.9%），天津市科密欧化学试剂有限公司；
4 mol/L氢氧化钾甲醇溶液：称取22.4 g氢氧化钾于烧杯中，加入适量无水甲醇使其溶解，并转移至100 mL的容量瓶中，当氢氧化钾甲醇溶液冷却至室温后，用无水甲醇稀释至刻度，摇匀。
二十二碳六烯酸（DHA）甲酯标准品：质量分数为99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；
十三碳烷酸甘油三酯标准品：质量分数为99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱：30 m×0.25 mm（内径）×0.25 μm（膜厚）Rtx-5 毛细管柱；检测器：附氢火焰离子化检测器（FID）；流速：载气（N2）30 mL/min，空气400 mL/min，氢气40 mL/min。温度：柱温采用程序升温，起始温度为100 ℃，保留3min，以10 ℃/min上升到260 ℃，保留6 min，气化室温度为250 ℃，分流进样（分流比为1：10），检测器温度为300 ℃；进样量：1 μL。
1.2.2分析步骤
Ⅰ 外标法
（1）样品制备：准确称取0.1 g（精确至0.1 mg）试样于100 mL容量瓶中，加入适量正己烷使其溶解，并稀释至刻度，摇匀。准确移取2 mL正己烷溶解液于10 mL带盖离心管中。
（2）测定：①标准曲线制备：准确称取0.07850 gDHA甲酯标准品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀作储备液，此时DHA甲酯储备液浓度为777.15 μg/mL。分别移取储备液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀。此时的浓度分别为0、77.715、155.43、310.86、466.29、621.72 μg/mL的DHA甲酯标准溶液。
用气相色谱外标法所建立的DHA甲酯标准曲线图
采用DHA甲酯作为标准品进行分析检测，以DHA甲酯的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得到标准曲线图，见图3.
DHA甲酯标准曲线方程为：
该标准曲线在DHA甲酯浓度在（0～777.15）μg/mL范围内线性良好。
②样品的处理：加入0.2 mL氢氧化钾甲醇溶液，漩涡震荡1 min，放置10 min（甲基化反应）。然后在离心机上以4000 转/min离心10 min。取上层有机相溶液经0.45μm有机相滤膜过滤，上机备用。
Ⅱ 内标法
（1）样品制备：准确称取0.1 g（精确至0.1 mg）试样和移取10 mL 1162.854 μg/mL十三碳烷酸甲酯于100 mL容量瓶中，加入适量正己烷使其溶解，并稀释至刻度，摇匀。准确移取2 mL正己烷溶解液于10 mL带盖离心管中。
（2）测定：①标准使用溶液制备：准确称取0.07850 gDHA甲酯标准品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀作储备液，此时DHA甲酯储备液浓度为777.15 μg/mL。准确称取0.11746 g十三碳烷酸甘油三酯标准品于100 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀作储备液，此时十三碳烷酸甘油三酯储备液浓度为1162.854 μg/mL。分别移取2 mLDHA甲酯储备液和1 mL十三碳烷酸甲酯储备液，用正己烷定容至10 mL，此时得到DHA甲酯的浓度为155.43 μg/mL和十三碳烷酸甘油三酯的浓度为116.285 μg/mL的混合标准储备液。取上述标准储备液2 mL，加入0.2 mL氢氧化钾甲醇溶液，漩涡震荡1 min，放置10 min（甲基化反应）。然后在离心机上以4000 转/min离心10 min。取上层有机相溶液经0.45μm有机相滤膜过滤，上机备用，此时得到DHA甲酯的浓度为155.43 μg/mL和十三碳烷酸甲酯的浓度为116.285 μg/mL的混合标准使用液。
②样品的处理：加入0.2 mL氢氧化钾甲醇溶液，漩涡震荡1 min，放置10 min（甲基化反应）。然后在离心机上以4000 转/min离心10 min。取上层有机相溶液经0.45μm有机相滤膜过滤，上机备用。
1.2.3 DHA甘油三酯结果计算：
2 结果与分析
在已知质量浓度的样品中加入3种浓度的DHA甲酯标准品溶液，制备成样品，每个样品连续测定6次，分别计算各种浓度加标量的精密度和回收率，检验方法具有稳定性和可行性，所得结果见表1和表2。
由表1和表2可知，两表中3种加标量的回收率均大于92%，确保了检测方法的可行
性；而精密度均小于2%，则确保了结果的稳定性和准确性。
3 讨论
本实验建立了通过气相色谱外标法来准确测量食品添加剂-DHA的一种全新的方法。这样避免了用内标法时，还要对内标物进行甲酯化实验。气相色谱外标法线性关系良好，为我们测定DHA含量时，提供了一种新的思路，也为我们节约了实验成本。实验实验数据表明，可以得出：用外标法所测定的DHA甲酯的回收率和精密度都达到了很高的要求，说明了外标法的可行性。
参考文献：
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[3] 张义明.DHA的来源及合理应用[J].食品工业科技，2003（8）：98～100.
[4] 曹万新，孟橘，田玉霞.DHA的生理功能及应用研究[J].中国油脂，2011，36（3）：1～5.
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[10] 吴克刚，孟宏昌.婴幼儿配方奶粉强化DHA和AA的研究[J]中国乳品工业，2004，32（2）：38～40.
[11] 中华人民共和国卫生部提出，中国国家标准化管理委员会.GB 26400-2011 食品安全国家标准 食品添加剂 二十二碳六烯酸油脂（发酵法）[S].北京：中国标准出版社，2011： ～.
作者简介：
程水连（ 1979 - ） ，女，湖南省益阳市产商品质量监督检验所 工程师，硕士。