大白菜游离小孢子培养技术研究进展
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摘 要：综述了影响大白菜小孢子培养的主要因素，阐述了影响大白菜小孢子植株再生的因素，总结了大白菜小孢子胚再生植株的继代与加代技术，提出了该技术存在的问题，并展望了这项技术在研究和生产实践中的应用前景。
大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis （Lour.） Olsson）是一种原产于我国的重要蔬菜作物，属十字花科芸薹属芸薹种大白菜亚种，在我国秋冬季蔬菜的生产与供应中居主导地位，是我国栽培面积最大、产量最高的蔬菜作物。大白菜为异花授粉植物，杂种优势明显，目前主要采用常规自交的方法选育杂交种亲本系，此法所需年限较长，要育成纯合的可利用亲本需要5~7 a时间。游离小孢子培养（isolated microspore culture，IMC）技术是一种新兴的生物技术，它具有单细胞、单倍体和较高胚胎发生率及较高同步性等特点。利用游离小孢子培养技术可以迅速获得双单倍体（doubled haploid，DH）纯合植株，进而获得纯合亲本系，2~3 a便可获得完全纯合的等基因纯系，大大加快了育种进程。20世纪80年代末期，日本学者Sato等[1]首次通过游离小孢子培养技术获得了春性早熟型大白菜的小孢子胚和再生植株；20世纪90年代初期，我国许多学者开展了大白菜游离小孢子培养[2~5]。此后，国内外学者在影响大白菜小孢子胚形成因素和小孢子胚发生机制、小孢子植株再生和加倍机制及游离小孢子培养技术的实践应用等方面做了大量有意义的探索，并取得了许多重要的研究进展。
1 影响大白菜游离小孢子胚胎发生的因素
1.1 供试材料对小孢子胚胎发生的影响
①基因型 基因型是影响小孢子胚胎发生率的关键性因素。基因型对大白菜小孢子胚胎发生能力的决定作用体现在2个方面：a.基因型的反应范围。曹鸣庆等[2]、栗根义等[4]、蒋武生等[6]均认为大白菜游离小孢子胚胎发生能力较强，能成胚的基因型分别为94.12%，92.31%和87.50%；许艳辉等[7]的试验结果则显示大白菜游离小孢子能成胚的基因型比率较低，仅为18.92%。b.胚胎发生频率（产胚率）的差异。许多研究结果表明，不同基因型大白菜的胚状体发生能力有明显差异[2，4，6~14]；四倍体大白菜植株的游离小孢子培养同样证明基因型对小孢子胚胎的发生能力有显著影响[15]。姜立荣等[16]的研究表明，大白菜小孢子胚胎发生能力同其他遗传性状一样，是一种受基因调控的遗传特性[16]，基因型是影响大白菜小孢子胚胎发生启动与否的内在因素[17]。
大白菜小孢子胚胎的发生能力还与植株类型有一定的相关性。刘凡等[18]报道叠抱型大白菜的小孢子产胚率高于合抱型，早熟型的产胚率高于中、晚熟型；方淑桂等[19]报道拧抱炮弹型大白菜小孢子胚诱导率和胚产量高于叠抱头球型。
②外部环境 供体植株生长的温度条件是影响小孢子培养的关键因子。一般从发育健壮的植株上取花蕾进行培养效果较好。现蕾期植株处于较低温度条件下，昼夜温度为10~25℃，胚状体产量较高[3]。日照长度对小孢子产胚量也有一定影响，长日照（14~18 h）和低温（15~20℃）条件下的植株胚状体发生数及植株再生率高[7]。方淑桂等[9]的研究表明，供体植株采蕾期的气温条件是小孢子胚胎发生的关键因素，采蕾前3 d的气温为14℃/24℃（夜/昼）时最适宜小孢子发育。因此，在无人工气候室的情况下，宜在春季（3~4月）进行大白菜小孢子培养，以避开秋季日照短、温度高等不利小孢子培养的环境[15]。
③生理状况 供体植株的株龄和花序龄对大白菜小孢子胚胎发生的影响不同。申书兴等[15]的研究表明，株龄对二倍体和四倍体大白菜品种的小孢子胚胎发生率影响显著，盛花期是进行大白菜小孢子培养的适宜时期。方淑桂等[9]的研究表明，盛花期的花蕾和供体植株的营养状况良好，有利于胚胎发生及植株再生。轩正英等[20]的研究表明，株龄对胚诱导率有一定影响，在盛花期和末花期采集花蕾进行大白菜游离小孢子培养的产胚率最高。周英等[10]的研究表明，盛花期大白菜小孢子的出胚率高于初花期和末花期，张亚丽等[13]和王秀英等[21]的研究结果与其相同，王秀英等还进一步指出下午取蕾优于上午。
1.2 孢子对小孢子胚发育的影响
①发育时期 选择发育时期合适的花粉是提高大白菜花粉诱导频率的重要措施。胚胎发生的激发启动大致发生在单核中期至单核靠边期这一短暂的发育过程中[1，16]，该时期小孢子的最大特征是有1个大的占整个细胞体积50%以上的中央液泡，细胞核被挤压至靠近细胞壁， 细胞质相对不透明，其内含有丰富的核糖体，大量的粗面内质网、线粒体、质体等随机分布于细胞内。与二倍体植株相似，
四倍体大白菜的小孢子发育时期对胚胎产率有显著影响，单核靠边期小孢子占多数时胚胎产量最
高[15，17]。曹鸣庆等[3]研究发现，花蕾长与小孢子发育进程密切相关。当CC11基因型大白菜的花蕾长2.0~2.5 mm时，处于单核中期的小孢子占41.7%，处于单核靠边期的小孢子占58.3%，此时小孢子胚胎产量最高。邹金美[17]的细胞学观察结果表明, 当花蕾长为2.0~3.0 mm、花瓣与花药长度比为1/2~4/5时，50%~70%的小孢子处于单核靠边期，此条件最宜进行大白菜花药和游离小孢子培养。花蕾大小还与接种材料的栽培条件有关，如在接种温室栽培的F1代材料的花蕾长为6~7 mm时，小孢子仍处于单核晚期，但生长在大田的大白菜植株进行花药和小孢子培养的合适花蕾长仅为2~4 mm。因此，应结合细胞学与植物学特征确定取材时间和取样大小。
②接种浓度 接种浓度是影响小孢子培养成功与否的重要因素之一，小孢子浓度过高和过低均不利于胚的发育。浓度过高时，其会消耗大量的营养物质，并且释放许多有害物质，影响胚的发育；小孢子发育需要群体效应，浓度过低同样不利于小孢子胚胎的生长发育。一般认为小孢子密度为2×104~4×104个/mL最合适，而最近的研究表明，接种浓度为1×105~2×105个/mL最合适[22]。
1.3 培养基成分对小孢子胚胎发生的影响
①基本培养基 培养基是诱导胚胎发生的基础，其不仅影响小孢子细胞的分裂，而且对胚状体再生植株的过程也有重要的影响。栗根义等[5]用改良的Lichter 培养液、日本学者Sato等[1]采用大量元素减半的NLN（Nitsch and Nitsch）培养基、张凤兰等[8]采用BM培养基进行了大白菜游离小孢子培养。近年来，许多学者采用NLN基本培养基进行了大白菜游离小孢子培养，其培养效果较其他培养基大大提高[3，4，6，9，19~21]。也可采用NLN基本培养基进行四倍体大白菜的游离小孢子培养[15]。
②蔗糖 进行大白菜游离小孢子培养时多以蔗糖作碳源。蔗糖不但能提供小孢子生长所需的能量，而且还能维持细胞的渗透压。蒋武生等[23]比较了不加任何激素但添加不同浓度蔗糖的NLN培养基进行小白菜游离小孢子培养的效果，结果表明蔗糖浓度为13%时培养效果较好，可为大白菜游离小孢子培养提供参考。也有研究选择10%和17%的蔗糖浓度，结果表明，高浓度的蔗糖可保持小孢子的活力，而低浓度的蔗糖能促进小孢子的分裂及发育。
③外源激素 大白菜游离小孢子培养中，外源激素对其胚的形成和植株再生的影响尚未取得一致的结果。轩正英等[20]的研究表明，在培养基中加入6-BA能明显促进胚状体的发生，6-BA浓度为0.05 mg/L时胚产量最高；张亚丽等[13]和付文婷等[14]的研究认为，6-BA对胚状体的发生和发育有促进作用，6-BA的适宜浓度为0.2 mg/L；徐艳辉等[8]也报道，6-BA 对大白菜的小孢子胚胎发生有一定的促进作用，最佳浓度为0.2 mg/L，但是对难成胚的基因型，6-BA的作用不大。韩阳等[24]的研究认为6-BA的最适浓度为0.4 mg/L，而NAA的浓度为0.10~1.00 mg/L时，抑制大白菜小孢子胚的发生，且浓度越高，其抑制作用越大。另外，在进行四倍体大白菜的小孢子培养时发现，6-BA浓度为0.2 mg/L、NAA浓度为0~1.0 mg/L时，大白菜小孢子胚的发生频率均较高，但当NAA浓度高于2.0 mg/L时出现抑制作用；当 NAA 浓度为0.5 mg/L、6-BA浓度为0.05~0.20 mg/L时，大白菜小孢子的产胚率高，但当6-BA浓度超过0.4 mg/L时出现抑制作用[15]。
耿建峰等[11]的研究表明，6-BA和NAA对大白菜小孢子胚的诱导率影响不大，但添加浓度过大时小孢子胚的诱导率降低。蒋武生等[6]的研究表明添加0.5 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA的培养基对大白菜小孢子的胚胎发生具有抑制作用。韩阳等[24]研究认为，较低浓度的细胞分裂素能促进胚状体的发生，且6-BA的作用大于ZT，ZT的最适浓度为0.2 mg/L；2，4-D对大白菜小孢子胚的形成有较强的抑制
作用。
④活性炭 在培养基中加入适量的活性炭可以加快培养进程，提高大白菜小孢子胚产量、子叶形胚率及胚状体发育的同步性[7，15，18，25~27]，但添加活性炭浓度不尽一致。徐艳辉等[7]报道，0.01~0.02 g/L活性炭可明显促进大白菜小孢子胚状体的形成。申书兴等[15，25]的研究发现，添加0.05~0.10 g/L活性炭对二倍体及四倍体大白菜小孢子胚生率和发育的同步性均有明显的促进作用；孙丹等[26]的研究表明，在培养基中添加0.10 g/L活性炭能增加大多数大白菜品种的小孢子胚产量，原因可能是适量的活性炭吸附了培养基中对胚产生具有毒害作用的物质。蒋武生等[27]的研究表明，0.50 g/L活性炭有利于大白菜小孢子胚的诱导和形成。刘凡等[18]的研究也发现，在培养基中添加1.40 g/L活性炭后，一些原本无胚状体形成的大白菜材料有胚状体形成，原本仅能形成较少胚状体的材料产生了较多的胚状体，但个别材料得不到胚或只能得到1至数个不能正常发育的胚；而韩阳等[24]的研究发现，高浓度的活性炭对大白菜小孢子胚的发生表现出抑制作用。
1.4 培养技术对小孢子胚胎发生的影响
①低温（冷击）预处理 温度在诱导小孢子产生胚状体培养条件中占有重要地位。培养前低温预处理花蕾，对大白菜小孢子的胚胎发生有一定的影响。Sato等[28]报道冷击预处理花蕾能提高大白菜小孢子胚发生率。轩正英等[20]的研究表明，花序在4℃下处理1~2 d后，大白菜小孢子的诱导率明显提高。路翠玲等[29]也得到了同样结果，并发现以未经低温处理或处理时间过长的花蕾进行培养，其胚状体的诱导率较低。耿建峰等[11]的研究表明，低温处理花蕾0~5 d，大白菜小孢子胚的诱导率差异不大，超过5 d其胚的诱导率则明显降低。
②高温（热激）预处理 当大白菜小孢子被接种到培养基上后，需用高温启动和诱导小孢子发育过程的改变，即从配子体发育过程转变为孢子体发育过程。栗根义等[4，5]认为，35℃高温预处理对大白菜游离小孢子胚状体的诱导很重要，其作用机制可能是通过改变小孢子的发育途径，阻止了小孢子向成熟花粉粒方向发展，促使其沿胚胎发育途径发展，最后形成小孢子胚。
姜立荣等[16]认为，以35℃高温诱导时，大白菜小孢子进行第1 次细胞分裂的方式多种多样，但对称分裂方式占优势。刘公社等[30]应用FDA和DAPI荧光显微技术，观察了高温处理对大白菜小孢子培养的影响，研究结果表明，在33℃高温下预处理24 h，然后转入25℃条件下培养，虽然小孢子第1天的成活率急剧下降，但随后仍保持一定水平；且膨胀后的小孢子多呈圆球形，以对称分裂方式为主；小孢子经多次分裂可形成紧密的多细胞团，最终形成胚状体。李菲等[31]的研究表明，大白菜小孢子主要发育途径为B途径，在33℃高温下预处理24 h后，单倍体小孢子体积膨大，染色体自然加倍，激发小孢子进入孢子体发育途径。
赵冰等[32]的研究表明，在33℃高温下预处理24 h对增加不同基因型大白菜材料的出胚量存在明显差别，诱导效率越高的基因型对高温的反应越敏感，出胚量增加的也越多。蒋武生等[6]研究发现，较易诱导产生胚的基因型，33℃高温下处理24 h对胚诱导率的效果最好，而对于难诱导产生胚的基因型在33℃高温下处理48 h后的胚诱导率较高。刘公社
等[30]认为大白菜小孢子培养的高温预处理时间应因基因型而异，一般应在24~48 h；若以高温诱导处理后的小孢子分裂频率为评价指标，小孢子接受高温处理的敏感期处于开始培养的12 h内；若以胚胎发生为评价指标，敏感期处于开始培养的24 h内。
③振荡培养 大白菜游离小孢子培养以固体和液体培养方式为主。一般液体培养基的营养物质容易被小孢子吸收，但其透气性较差，会导致褐色胚的产生。申书兴等[25]将培养14 d的大白菜小孢子置于摇床上培养（60 r/min）7 d，结果表明，振荡培养改善了培养基的通气性，促进原胚迅速发育成子叶型胚，提高了子叶胚率和胚状体发育的同步性，同时促进小孢子胚直接成苗。赵俊等[33]报道低频振荡（80 r/min）极大地提高出了大白菜小孢子的出胚数。
2 影响小孢子胚植株再生的因素
2.1 胚状体发育阶段
在早期的研究中，大白菜小孢子胚胎植株成苗率很低，只有5%~10%[1]。大白菜小孢子胚的植株再生受基因的影响，再生能力强的基因型易形成小孢子胚再生植株，但处于不同发育阶段的同一基因型的小孢子胚的成苗率差异很大，子叶期的胚具有迅速再生成苗的能力，鱼雷期的胚则较难成苗，处于球形期和心形期的胚则发育停滞。曹鸣庆等[2]的研
究表明，心形期至鱼雷期的胚胎移植后半数以上发育为幼苗，其中5%~10%为白化苗。韩阳等[34]研究发现，成熟的子叶形胚的成苗率可达20%；子叶已扩大的萌发胚成苗率可达90%以上；发育早期的胚较难成苗，尤其是心形胚和球形胚其成苗率均为0。
2.2 小孢子胚在液体培养基中的滞留时间
成熟的大白菜小孢子胚在NLN-13培养基中滞留的时间对其植株再生影响很大。刘凡等[18]的研究表明，将在液体培养基中滞留14 d和21 d的小孢子胚转移至MS0固体培养基中培养56 d时，其成苗率分别达到85%和81.6%，而停留28 d和35 d的小孢子胚最终的成苗率只有63.3%和42.7%，大大低于前两者。
2.3 固体培养基中的水分含量
许多研究表明，增加固体培养基中的琼脂含量可降低培养基的含水量，进而提高大白菜小孢子胚状体的再生植株率。韩阳等[34]的研究表明，大白菜小孢子胚成熟后需要较干燥的生长环境，因此及时将成熟的子叶期胚转入相对干燥的培养环境有利于植株再生；当培养基中的琼脂含量为1.2%时，最有利于大白菜小孢子胚成苗，再生株率为50.5%。刘凡等[35]以含琼脂1.2%的MS0培养基处理的大白菜小孢子胚的死胚数最少，再生植株成苗率最高，达到85.8%。申书兴等[25]在进行四倍体大白菜小孢子培养时发现，再生植株成苗率与培养基的水分含量有关，适宜胚状体成苗的培养基是B5+3%蔗糖+1.2%琼脂。据蒋武生等[23]报道，有利于大白菜小孢子胚成苗的培养基为B5+0.2 mg/L 6-BA+3%蔗糖+1%琼脂。
2.4 活性炭
刘凡等[18]的研究还发现经活性炭处理获得的大白菜胚状体在光照下转绿、萌发、成苗等方面的能力均不及未经活性炭处理的。原因可能是活性炭的吸附作用无选择性，当其浓度超过适宜浓度后，在吸附培养基中有害物质的同时，也吸附了其中的生长调节剂、铁盐、维生素等与胚生长和分化密切相关的物质。因此培养基中的活性炭浓度不宜太高，否则会起负作用。
韩阳等[34]的研究表明，培养基中添加活性炭的处理比不含活性炭的成苗率高20%~122.5%，其中添加200 mg/L活性炭的培养基最有利于大白菜小孢子胚的成苗。
3 小孢子胚的继代、生根和移栽
蒋武生等[23]的研究表明，大白菜小孢子胚在继代培养基B5+0.20 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA上可每25~30 d继代1次。小孢子胚再生出芽后，将高度为3~5 cm的健壮苗转到生根培养基MS+0.10 mg/L NAA上形成完整植株，植株具4~5片叶时移入盛有田园土的营养钵中，7 d后即可生根，10~15 d后成活，成活率可达95%。付文婷等[14]的研究结果与之相似，其认为B5+0.20 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA培养基有利于大白菜小孢子胚发育成植株，1/2 MS+
0.1 mg/L NAA 培养基最适宜大白菜小孢子植株生根。徐艳辉等[7]研究了KT和6-BA对大白菜小孢子胚再生植株的影响，结果表明，将小孢子胚接种在MS+0.8%琼脂+3%蔗糖+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA的固体培养基上，2个基因型的小孢子胚再生植株无性扩繁的成活率分别为82%和92.5%，继代培养后的大白菜小孢子胚再生植株在1/2 MS+3%蔗糖+0.8%琼脂+0.1 mg/L NAA上的生根培养基上生根良好，将已生根的再生植株移到1/2壤土+1/2粪土的盆中便可生长。张亚丽等[13]的研究表明，B5培养基中附加 0.10 mg/L GA3最有利于大白菜小孢子胚分化，1/2 MS培养基中附加0.10 mg/L NAA 最适合大白菜小孢子胚再生植株生根。而周英等[10]的研究表明，培养基MS+0.10 mg/L NAA最适宜大白菜小孢子胚再生植株生根。
赵岫云等[36]的研究表明，大白菜小孢子胚植株再生能力的遗传符合加性―显性模式，即其主要受核基因控制，基因作用以加性效应为主，高植株再生能力由隐性基因控制，其狭义遗传力为70.6%。这一研究结果为改良小孢子胚植株再生能力差的大白菜材料提供了一条有意义的途径，即可选用小孢子胚植株再生能力强的材料与之杂交，提高后代的植株再生能力，从而获得更多的再生植株。
4 小孢子植株的加倍技术
只有将小孢子培养所得到的再生植株的染色体加倍为二倍体，才能将其应用于育种实践。大白菜小孢子再生植株中出现DH植株的频率不完全相同，但频率均较高。曹鸣庆等[3]的研究结果表明，经由小孢子培养产生的大白菜小孢子再生植株的自然加倍率在50%~70%。李菲等[31]的研究表明，大白菜小孢子胚再生植株具有较高的自然加倍率，且其与小孢子培养时的热激诱导密切相关。张凤兰等[7]的研究表明，春秋两季大白菜品种的小孢子再生植株的自然加倍率不等，多数品种在70%，其还认为由大白菜游离小孢子培养得到的再生植株有自然加倍成为二倍体的特点。这一研究结果为游离小孢子培养技术在大白菜育种工作中的有效利用提供了广阔的前景。目前生产中主要用0.2~4.0 mg/g秋水仙碱处理再生的单倍体植株进行人工加倍。
5 问题与展望
综上所述，游离小孢子培养这一具有重要理论意义和实践价值的生物技术越来越受到科研工作者的重视，并已得到广泛的应用[37~46]。但其在应用中还存在许多理论和实际问题，如在适宜条件下，通过游离小孢子培养，大多数基因型的大白菜可以获得小孢子胚及再生植株，但也有少数基因型不能获得小孢子胚及再生植株；且这一技术尚未达到随意操作雄配子的程度；另外，在大白菜小孢子启动分裂的机理、微观发育机制、发育途径以及与之相关的生理生化方面的理论研究还十分欠缺。
利用游离小孢子培养技术能够在较宽的基因型范围内以较高的胚状体发生率获得大白菜小孢子胚和再生植株，但还远远没有达到建立起完善、高频的大白菜小孢子再生体系的程度。小孢子再生植株具有自然加倍成为二倍体的特点，在大白菜遗传和育种研究方面具有十分诱人的应用前景，但小孢子胚自然加倍成为二倍体的机制尚待进一步探讨。
今后应加强理论研究和提高实验技术方面的工作，建立能稳定、高效地获得纯合二倍体的游离小孢子培养体系，提高该技术在大白菜育种工作中利用的成功率和效率，并将其与传统育种技术有机结合，使之成为常规育种的一个重要组成部分。
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