类风关巴布剂穴位贴敷对关节炎模型大鼠滑膜细胞P53、Bcl-2、NF-κβ及其分泌的IL-1β、TNF-α的影响

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关键词 类风湿性关节炎 穴位贴敷 雷公藤 大鼠 细胞凋亡

类风湿性关节炎(RA)是慢性全身性自身免疫性疾病。其病理基础为关节滑膜的过度增生，病因不明，发病机制不清，临床表现复杂多样。本实验通过对关节炎模型（CIA）大鼠不同组合穴位贴敷类风关巴布剂，观察其对大鼠滑膜细胞凋亡的影响，并初步探讨经络腧穴在其中的作用，为临床用药提供实验依据。

1 实验材料

1．1 动物：Wistar大鼠，清洁级健康雄性，100只，体重120±15g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，正常饲养。

1．2 药物与试剂：雷公藤、白花蛇、乳香、没药等；乙醇、明胶、甘油、聚丙烯酸钠、氮酮、无纺布、聚乙烯薄膜；牛Ⅱ型胶原（Chondrex公司，美国），完全弗氏佐剂（Sigma公司，美国），il-1β ELISA kit（Biosource公司，美国），tnf-α ELISA kit （Biosource公司，美国），Bcl-2、P53、NF-κβ（Santa Cruz Biotechnology,inc，美国），多聚赖氨酸玻片100张，EiVision+ PolymerHRP(Ms/Rb) IHC kit 6ml。

1．3 仪器：显微镜OLYMPUS（日本），低温高速离心机 BECKMEN（美国），酶标仪Bio-rad680（美国）。

2 实验方法

2．1 类风关巴布剂的组成及制作方法：雷公藤、白花蛇、乳香、没药等共12味中药，按固定剂量配伍（其中雷公藤占总药量的28%），晒干，研粉，过20目筛，用80%乙醇渗漉提取，然后过滤取液，经低温低压（50℃，-0．8个大气压）蒸馏去乙醇后得浸膏，将浸膏按一定比例加入事先配制的巴布剂基质（主要成份为明胶、甘油、聚丙烯酸钠等）中，并加入0．5％的促渗剂（氮酮）及一定比例的乳化剂及防腐剂等，充分溶合，均匀涂于无纺布上，覆盖聚乙烯薄膜，切成3cm×3cm 的方块（重量１g），密封包装，阴凉处储存备用。

2．2 造模和分组：随机从100只大鼠中选出10只为正常对照，其余90只用于造模，参照文献[1]方法配制成Ⅱ型胶原乳剂。注射方法：于大鼠背部及尾根分5点行皮内注射，每点0．1ml，总量0．5ml（含1mg 牛Ⅱ型胶原）。15天后同法分两点皮内激发注射。正常对照组（空白组）予以生理盐水同法注射。初次免疫25天后参照关节炎指数评分标准[2]对造模效果进行评估，评分达6分以上的大鼠被用于继续实验，将造模成功的大鼠随机分为四组，类风关巴布剂局部贴敷组(局部组)、类风关巴布剂远道穴位贴敷组(远道组)、类风关巴布剂系统穴位贴敷组(系统组)和模型对照组(模型组)各10只。

2．3 给药方法：根据临床及有关动物实验的取穴方案[2]取穴。局部组取穴：双侧太溪，共2个穴点；远道组取穴：大椎、双侧肾俞，共3个穴点；系统组取穴：大椎、双侧肾俞、双侧太溪，共5个穴点。在穴位处脱毛后贴敷，每1天1次，共21次，每次雷公藤甲素剂量约为3．8μg[3]。正常组和模型组模仿局部组贴敷不含药物的巴布剂基质。21天后各组大鼠同时处死，取标本。

2．4 取材：大鼠称重，用2％戊巴比妥纳腹腔麻醉，仰位固定，沿着左侧后腿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出膝关节位中心约3cm×3cm的区域。沿髌骨上缘约0．3～0．4cm处向下切割至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了膝关节腔，可见由髌骨下极向下延续有一层平滑光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。用眼科直镊轻轻夹住其中央，用眼科剪完整剪下，置10％的中性甲醛中固定，用于检测P53、Bcl-2、NF-κβ的免疫组织化学染色。同法取右侧滑膜，滑膜取出之后，用生理盐水1ml冲洗关节腔，收集关节腔液和关节滑膜组织，用于IL-1β、TNF-α的检测。

2．5 检测指标：详见于下。

2．5．1 关节肿胀指数[4]：采用0~4级关节评分法。0分：无关节炎；1分：小趾关节肿胀；2分：小趾关节和足跖关节肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部关节肿胀。给药前为观察点，以后每周1次，共3次。

2．5．2 细胞因子的检测：IL-1β、TNF-α[5]活性测定采用ELISA法，按照所附说明书测定关节滑膜组织溶浆[6]的活性。

2．5．3 滑膜组织P53、Bcl-2、NF-κβ的ABC染色：按照所附说明书对滑膜组织P53、Bcl-2、NF-κβ进行ABC染色。

2．6 统计学处理：结果以x±ｓ表示，计量资料用 ｔ检验。

3 结果

3．1 关节肿胀指数测定：详见表1。治疗第２周时，穴位贴敷各组关节肿胀指数低于模型组，其中系统组、局部组与模型组比较有显著性差异（P

3．2 关节滑膜组织溶浆IL-1β、TNF-α活性测定：详见表2。TNF-α，系统组、局部组、远道组与模型组比较，有非常显著性差异(P

3．3 滑膜组织P53、Bcl-2、NF-κβ的ABC染色：类风关巴布剂对CIA大鼠滑膜细胞凋亡和p53等影响的实验结果详见表3。细胞凋亡计分[7],在滑膜组织中,凋亡细胞核呈深蓝或青紫色，每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中细胞的凋亡数，计数5~10个视野,标出每个视野平均细胞凋亡数。在滑膜组织中P53、bcl-2、nf-κβ蛋白表达阳性的滑膜组织细胞核呈橘黄色或棕黄色，每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中阳性细胞的占有率，计数3个视野，标出每个视野平均阳性细胞占有率，并按阳性细胞占有率分为5级：0，无阳性细胞；+，阳性细胞0～25％；，阳性细胞26％～50％；，阳性细胞51％～75％；，阳性细胞76％～100％。0级定积分为0，+积分为1，以此类推。

4 讨论

RA主要是机体对自身滑膜发生免疫反应的疾病，且以慢性进行性关节损害为特点，滑膜过度增生、增厚是造成关节损害的主要病理基础之一。有研究表明[8]，类风湿性关节炎的发生与滑膜的异常增生，细胞凋亡的减少有关。RA关节软骨和骨组织的损害主要是由于滑膜细胞的活化和增生而引起的，滑膜细胞过度增生源于滑膜细胞凋亡的相对不足。RA病人滑膜细胞存在细胞凋亡过程的异常。这些异常与P53、Bcl-2等表达异常及体内其他调节因素(如细胞因子等)有关。有研究认为[9]Bcl-2在RA滑膜衬里层细胞中呈高表达可导致凋亡障碍，并与细胞增值相关。IL-1β前体由滑膜组织的单核细胞或滑膜细胞所分泌，并在细胞内由ICE(IL-1β转化酶)水解为IL-1β，具有较强的致炎作用，有实验表明它参与了RA的滑膜病变，它能刺激IL-6、IL-8和VEGF的分泌，IL-1与其I型受体相结合，触发MAPKs级联，导致NF-κβ移至核内。另据研究IL-1β以剂量依赖方式抑制滑膜细胞Fas的表达，既抑制凋亡[10]。TNF-α对RA滑膜细胞凋亡也有重要影响，它不仅直接引起滑膜细胞的增殖，还可刺激IL-2及TNF-α本身的分泌，进一步引起滑膜细胞的增生。近来研究发现，TNF-α过量表达可减少RA关节内Fas介导的细胞凋亡，继而有助于滑膜细胞的增殖[11]。NF-κβ普遍存在于真核细胞，能与多种基因的启动子或增强子上的特异性位点结合，并促进基因转录的一类蛋白质的总称。NF-κβ通过调节许多细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子及多种酶的基因表达，参与机体免疫调节和炎症反应，并在细胞增殖、分化及凋亡方面起关键作用。NF-κβ与RA的相关研究成为热点之一。研究[12]证明NF-κβ与血管翳生成、关节软骨侵蚀密切相关。NF-κβ活性明显升高的结果是多种炎性因子、趋化因子、生长因子、粘附分子、受体及酶等物质生成相应增多，而在前炎性细胞因子TNF-α和IL-1介导的NF-κβ异常活化中，NF-κβ起主要的调控作用。本实验我们采用四肢关节肿胀指数评价动物四肢的关节炎症，与以前的结果[13]相似，治疗后各穴位贴敷组与模型组比较均有明显改善（P

今后的研究目标，从微观看，要从分子生物学的角度（如基因、信号转导机制等）深入研究作用的主要机理；从宏观看，应该进一步优选药物和穴位处方，以达到最佳疗效。

5 参考文献

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收稿日期 2008-04-16

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