丹红注射液对大鼠脑外伤AQP4表达及神经元凋亡的影响
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摘要：目的 观察丹红注射液对大鼠脑外伤后水通道蛋白4（aqp4）表达及神经元凋亡的影响，探讨丹红注射液对脑外伤的治疗作用。方法 健康雄性Wistar大鼠150只，随机分为对照组和治疗组，每组75只， 每组又分为伤后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5个亚组，每个亚组15只。采用Feeney法建立自由落体脑损伤动物模型，治疗组大鼠致伤后1 h腹腔内注射丹红注射液1.5 mL/kg，对照组相同时间腹腔内注射同体积生理盐水。在预定时间点每亚组随机抽取5只大鼠应用干湿重法测定大脑半球含水量，余下10只大鼠经心脏灌注后取脑制作石蜡切片分别行HE染色、免疫组织化学法测定AQP4表达、TUNEL法测定神经元凋亡。结果 对照组大鼠脑含水量、AQP4表达及神经元凋亡在伤后6 h即开始增加，伤后24 h～48 h 达到高峰，72 h时明显下降；与对照组比较，丹红注射液治疗组大鼠脑含水量、AQP4表达及神经元凋亡在相应各时间点均明显降低，在外伤后12 h及24 h时差别有统计学意义（P
关键词：丹红注射液；脑外伤；水通道蛋白；神经元凋亡；大鼠
中图分类号：R651.1 R289.5 文献标识码：A 文章编号：1672
水通道蛋白 （aquaporin，AQP）是近年来发现的一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白，其中AQP4（Aquaporin4，AQP4）的作用最引人注意，抑制AQP4的表达可减缓脑水肿的形成，从而降低神经系统疾病的病死率和致残率[1]。以往认为坏死是颅脑损伤神经细胞唯一的死亡方式，近年研究表明脑外伤后神经元死亡包括坏死与凋亡两种方式，神经元凋亡在创伤性脑损伤后水肿神经元的转归中占据重要地位[2]。细胞坏死不可修复，人们试图通过对凋亡途径的调控从而更好地改善脑外伤后的预后，这方面的研究是当前颅脑外伤研究的热点之一。
近年来，关于丹红注射液的脑保护作用的研究越来越多，但关于丹红注射液对脑外伤后脑组织中AQP4的表达及神经元凋亡影响的研究较少。为此，本实验应用大鼠建立脑外伤模型，观察丹红注射液对大鼠脑损伤后AQP4表达及神经元凋亡的影响，以期为脑损伤的治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠150只（3月龄），清洁级，体重250 g～300 g，青岛市动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鲁）20030010。随机分为对照组和治疗组，每组75只，每组又分为伤后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h 5个亚组，每个亚组15只。
1.2 脑损伤模型的建立 大鼠急性脑损伤模型参照Feeney法[3]制作并加以改进。打击器由固定支架、外周套管、打击垫片和下击落锤组成，击锤重20 g，下落高度为50 cm，落体致伤力20×50（g·cm）。大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后（0.4 mL/100 g体重），俯卧位固定在手术台上，常规消毒皮肤，备皮，沿矢状缝切开头皮，暴露右顶骨，在人字缝前2 mm，矢状缝右侧2 mm处用牙钻行颅骨钻孔并扩大成5 mm×5 mm骨窗，保持硬脑膜完整，将直径5 mm圆垫片放于骨窗处，将大鼠俯卧固定于一已知弹性系数的海绵床上，移至有机玻璃管下端 ，垫片正对有机玻璃管中央，有机玻璃管上方置一滑轮，在铜柱上端系一小绳，将滑轮调整至绳索跨过滑轮后铜柱处于有机玻璃管中央为止。待动物开始苏醒，有肢体活动时，将铜柱由预定高度自由坠落于不锈钢垫片上，立即移开海绵床以免再次损伤，下陷深度约2 mm。下落击锤致右顶叶脑损伤后缝合头皮。
给药过程：治疗组大鼠致伤后1 h腹腔内注射1.5 mL/kg丹红注射液；对照组致伤后1 h腹腔内注射同体积生理盐水。
1.3 脑组织取材及处理 在预定各时间点，每组取5只大鼠，断头取脑后用滤纸蘸净大脑表面水分，取脑损伤周围脑组织150 g左右，用电子分析天平称大脑半球湿重，然后放入110 ℃烤箱烘烤24 h，再称干重。每组剩余10只大鼠在预定各时间点经腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.5 mL/100 g体重），常规胸腹联合切口，经心尖将灌注针插入主动脉，依次用生理盐水500 mL、4 ℃的4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液500 mL灌注固定。断头后沿冠状面提取脑损伤部位前后2 mm组织，后固定2 h，洗涤4 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。连续冠状切片，片厚5 μm，贴片后室温保存备用。
1.4 观察指标
1.4.1 大脑半球含水量测定 用干湿重法计算脑含水量，即脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。
1.4.2 HE染色 石蜡切片常规脱腊至水，苏木精伊红染色，光镜观察损伤及周边区神经元形态。
1.4.3 AQP4表达免疫组化检测 兔抗鼠AQP4多克隆抗体及SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德公司，按试剂盒说明书操作，DAB显色，光镜观察。每只动物取三张连续切片，每张切片高倍镜下（400倍）随机观察损伤周边区不重叠的2个视野，计数AQP4阳性细胞平均数，以个/高倍镜视野表示。
1.4.4 TUNEL法检测细胞凋亡 原位未端标记（TUNEL）试剂盒由武汉博士德生物工程公司提供，按说明书操作，DAB显色，光镜观察。细胞核中出现棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞。每只动物取三张连续切片，每张切片高倍镜下（400倍）随机选取损伤周边区不重叠的2个视野，计数TUNEL阳性细胞平均数，以个/高倍镜视野表示。
1.5 统计学处理 所有数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.0统计软件，组间比较应用单因素方差分析，各实验组间的两两比较采用q检验。
2 结 果
2.1 丹红注射液对大鼠脑损伤后脑含水量的影响 与对照组比较，治疗组各时间点脑组织含水量减少，其中在伤后12 h及24 h时与对照组比较差异有统计学意义（P
2.2 HE染色 对照组创伤区细胞间隙和血管周围间隙增宽，有神经元和胶质细胞坏死、崩解；损伤周围区神经元胞体明显肿胀，血管内皮细胞肿胀，细胞水肿，少量胶质细胞增生，有大量炎性细胞渗出，局部可见到炎性细胞聚集和红细胞渗出。在高倍镜下观察，损伤周围区较多神经元外形皱缩，核染色质浓缩、深染，核膜境界不清，细胞间隙增大，呈现典型凋亡细胞核形态。提示在创伤中心区细胞多表现出坏死，在损伤周围区，细胞多表现为凋亡。丹红注射液治疗组在创伤区及损伤周围区上述病理学改变明显减轻，坏死及凋亡细胞较对照组明显减少。
2.3 AQP4表达免疫组化检测 AQP4阳性反应产物呈棕黄色颗粒，主要分布在胞膜，胞质和胞核中少见，阳性细胞呈空泡状，主要位于创伤周边的水肿区、创伤侧的皮质和血管周围及白质的星形胶质细胞、脉络丛、室管膜等处。两组AQP4阳性神经元计数见表2。对照组脑外伤后6 h，AQP4的表达即开始增高，伤后24 h～48 h达到高峰，至72 h时已明显下降。与对照组比较，治疗组在相应时间点AQP4阳性细胞数均降低，其中在伤后12 h及24 h时与对照组比较有统计学意义（P
2.4 TUNEL法检测细胞凋亡 光镜观察，细胞核中出现棕黄色颗粒者为TUNEL阳性细胞，即凋亡细胞，主要位于打击灶周边区。两组凋亡神经元计数见表3，对照组在伤后6 h即可检测到少量凋亡神经元，伤后24 h～48 h达到高峰，而此后凋亡细胞数则呈现下降趋势。丹红注射液治疗组在上述各时相点则检测到较对照组明显减少的凋亡细胞，在伤后24 h及48 h与对照组比较差别有统计学意义（P
3 讨 论
水通道蛋白是近年来新发现的一个膜通道蛋白家族，在介导水跨胞膜的流动中起关键作用，在脑内分布广泛，其中AQP4目前被认为是介导脑组织中水分子流动的最主要的水通道蛋白，成为脑水肿研究的焦点。它的表达变化对外伤性脑水肿非常敏感，抑制AQP4可为减轻脑水肿提供新的治疗途径[1]。
本实验结果表明，对照组造模后脑组织含水量为一动态变化的过程，在脑外伤后进行性发展，24 h～48 h达到高峰，然后逐步回落至接近正常。这和临床上脑外伤患者病情多在2 d内恶化相一致。AQP4蛋白的表达也呈现出这一趋势，与脑含水量有明显的相关性，这与以前研究的结论相同[4]。
近几年，经过一系列的脑外伤动物模型及人脑组织标本的研究证实了脑外伤后细胞凋亡参与了继发性脑损伤的发展过程。研究表明，在机械性脑损伤后早期在外力打击较严重的中心区主要表现为细胞坏死，而在外力打击相对较轻的损伤灶周边部位，伤后一段时间内表现为细胞凋亡[5，6]。细胞坏死不可修复，人们试图通过对凋亡途径的调控而更好地改善预后，在外伤性脑损伤中，通常所说的脑保护效应，主要是避免神经元的迟发性损伤， 以图打断病变发展进程，使脑功能受损减到最低程度。本实验中，对照组HE染色及TUNEL染色都表明在损伤灶附近细胞凋亡是伴随着细胞坏死的病理过程，这两种不同的死亡过程共同参与了神经元的丢失。
丹红注射液是丹参和红花提取物的中药制剂，临床及实验研究表明，丹参可提高抗凝和纤溶功能，对动脉粥样硬化的形成也有抑制作用，可改善微循环，清除氧自由基，抗脂质过氧化损伤，拮抗钙离子内流，改善ATP酶活性。红花可以抗凝血，抑制血栓形成，所含的红花黄色素具有抗氧化作用，可通过抑制肾素血管紧张素系统具有降血压作用[7]，红花提取物有Ca2+拮抗作用，可防止脑缺血致神经内Ca2+浓度超负荷而造成的脑损伤。
脑损伤后，病人常出现红细胞聚集，血流缓慢以及血浆纤维蛋白原升高等现象[8]。血黏度升高及红细胞聚集性增强可使脑血流淤滞，循环阻力增高，最终导致脑微循环障碍，脑缺血缺氧，加剧脑水肿和继发性脑损坏。丹红注射液可以通过改善脑循环血液流变学性质，增加脑组织血流，纠正缺血缺氧所致的神经元代谢紊乱，从而减轻脑水肿和继发性脑损害。同时丹红注射液具有Ca2+拮抗作用，抑制神经元膜脂质过氧化，维持神经元细胞内离子内环境平衡，而发挥脑保护作用。最新研究表明[9]丹参能降低脑内单胺类、肽类等介质代谢紊乱，减轻脑水肿。
神经细胞凋亡受基因调控，如bcl2的表达降低或bax表达增多与神经细胞凋亡高度相关。最近研究证实丹参注射液可抑制bcl2表达降低与bax表达增多。当脑缺血发生后，丹参能下调另一细胞凋亡相关基因白细胞介素1β转化酶（ICE）的表达，上调脑缺血后的bcl2表达而发挥其神经保护作用[9]。
临床上丹红注射液常用于冠心病、心绞痛、心肌梗死、瘀血型肺心病、缺血性脑病、脑梗死，脑水肿等心脑血管疾病的治疗，对急性脑梗死患者疗效显著[10]。本实验中丹红注射液治疗组AQP4表达较对照组表达明显减少，自伤后6 h～72 h 都有不同程度的减少。TUNEL染色也显示丹红注射液治疗组神经元凋亡较对照组表达明显减少。两组染色都显示在伤后12 h及24 h时与对照组比较差异有统计学意义，说明丹红注射液对颅脑损伤后脑水肿及神经元凋亡有明显的治疗作用，且这一治疗作用在伤后12 h至24 h时最为显著。本试验结果提示对于脑外伤病人有针对性地使用丹红注射液对病人的预后可能会有所帮助，但其发挥脑保护作用的用药剂量与时机还需要更进一步的研究。
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