玫瑰多糖的酶法提取及柱前衍生HPLC分析

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摘要：通过酶法提取玫瑰多糖，用柱前衍生高效液相色谱法分析含量。结果表明，非酶法对干花和玫瑰花渣的多糖提取率分别为9.865、5.087 g/100 g；酶法对其的多糖提取率为12.487、7.599 g/100 g。用柱前衍生高效液相色谱法分析玫瑰多糖，发现该多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖组成的，其物质量比为0.934 4∶0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5。酶法提取和不加酶提取的玫瑰多糖一级结构的糖组成相同。

关键词：玫瑰多糖；酶法提取；柱前衍生；一级结构

中图分类号：O657.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）20-5031-03

Analysis of Rose Polysaccharide by Enzyme Extraction and Pre-column

Derivatization hplc

ZHANG Yue-hui1，HAN Li-wen2，ZHENG Lan2，SHI Jian-guo2，YANG Jun-hui2，MA Yao-hong1

（1.Shandong Institute of Light Industry， Jinan 250353， China； 2. Biology Institute / Key Laboratory for Biosensor of Shandong Province，Shandong Academy of Sciences， Jinan 250014， China）

Abstract： Polysaccharide of rose was extracted by enzyme method and analyzed by HPLC with pre-column derivatization. The results showed that the yield rate of rose polysaccharide from dried flowers and rose dregs by normal method were 9.865 g/100 g， 5.087 g/100 g， respectively. The yield rate of rose polysaccharide by enzyme method were 12.487 g/100 g， 7.599 g/100 g， respectively. The results of monosaccharide composition of rose polysaccharide by HPLC with pre-column derivatization showed that it was composed of mannose， rhamnose， glucuronic acid， glucose， galactose and arabinose with a molar ratio of 0.934 4∶0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5. The sugar composition of primary structure of rose polysaccharide extracted by enzyme method was the same as those extracted by normal method .

Key words： rose polysaccharide； enzyme method extraction； pre-column derivatization； primary structure

多糖作为一种生命活性物质，具有清除自由基和抗肿瘤作用[1，2]。孔心渭等[3]通过肿瘤坏死因子（TNF）单克隆抗体的ELISA法，发现野玫瑰多糖通过调节肿瘤坏死因子的分泌而对急性肾炎有一定的治疗作用。白伟芳[4]测定了玫瑰花多糖在体外对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除作用，以及玫瑰花多糖的抗肿瘤活性。玫瑰花中的总糖质量浓度高达29.5 g/100 g，其中可溶性糖8.8 g/100 g。马猛华等[5]提取玫瑰花中多糖，提取率为0.6 g/100 g。陈晓梅等[6]分析了铁皮石斛原球茎多糖的结构和功能。本试验分析了玫瑰花提取精油后废水废渣中多糖的提取方法，并以1-苯基-3甲基-5吡唑啉酮（PMP）作为柱前衍生剂[7，8]，采用HPLC分析其单糖及糖醛酸的组成，并鉴定酶法对单糖及糖醛酸的组成有无影响，以期为多糖结构及功能研究和玫瑰花的综合开发利用提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰干花以及经提取玫瑰精油的干玫瑰花渣由济南惠农玫瑰花精油有限公司提供；纤维素酶（山东食品发酵工业研究设计院，食品级4万酶活）；果胶酶（山东食品发酵工业研究设计院，食品级3万酶活）；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖均购自美国Sigma公司。

色谱纯乙腈；1-苯基-3甲基-5吡唑啉酮（衍生化试剂PMP）、浓硫酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、次甲基蓝、亚铁氰化钾等均为分析纯；去离子水。

1.2 仪器

SGD-Ⅳ还原糖测定仪（山东省科学院生物研究所）；HH-S恒温水浴锅（江苏国胜实验仪器厂）；电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；FA1004N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）；101A-2电热鼓风干燥箱（南通宏大实验仪器有限公司）；L-2000型高效液相色谱仪（日立公司）；Alltech Apollo C18色谱柱（美国奥泰公司）；20PR-52D冷冻高速离心机（日立公司）；TGL-16G飞鸽牌离心机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A漩涡混合器（上海精科实业有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰花多糖酶法提取方法 称取36 g玫瑰干花2份，标记为A、B；称取玫瑰花渣2份，标记为C、D。用纤维素酶处理A、C，条件为：50 ℃，pH 4.6，150 min，酶加量为4.5 g/100 g[9]，加液量为8∶1；然后再用果胶酶[10，11]处理A、C，条件为：45 ℃，pH 3.5，120 min，酶加量为0.1 g/100 g。B、D分别在50 ℃水浴150 min、45 ℃水浴120 min。最后，将A、B、C、D补水至料水比为1∶30[5]，100 ℃提取5 h，并以3 500 r/min离心15 min，取上清液加热浓缩至100 mL，待温度降至60 ℃后倒入5倍体积60 ℃、95%（V/V）的乙醇中，封口静置12 h。取下层沉淀离心，沉淀转移至平板中，用去离子水冲洗以确保多糖完全转移至表面皿，并置于60 ℃烘箱中烘干，称重。

1.3.2 多糖水解 分别称取上述玫瑰多糖样品0.5 g，置于具塞试管内，加入10 mL 1 mol/L的H2SO4于沸水浴中水解8 h，同时设置一组空白对照，以去离子水代替H2SO4。水解后，将水解液和空白对照于10 000 r/min离心10 min，取上清液4.5 mL用NaOH溶液调节pH至7，并定容至10 mL，以10 000 r/min离心10 min，取上清液待衍生化[12-15]。

1.3.3 柱前衍生 称取4.355 g PMP溶于50 mL甲醇中，配制0.5 mol/L PMP溶液；称取6.978 g醋酸铵和0.9 mL乙酸，以去离子水定容至1 L，配制pH 5.5的醋酸铵溶液。准确配制2 mmoL/L的甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等8种单糖标准品单品溶液及混合溶液。取该溶液50 μL，加入50 μL 0.5 moL/L的PMP甲醇溶液及50 μL 0.3 mol/L的NaOH溶液，涡旋30 s，70 ℃反应30 min。冷却至室温，再加入50 μL 0.3 mol/L的HCl、100 μL去离子水稀释混匀后，加入900 μL氯仿涡旋混匀30 s，静置5 min，弃去下层液，再重复加入氯仿萃取2 次，上层液即为标准品衍生液。取50 μL待测样品按照上述衍生方法处理，得衍生化样品。每个样品设3个平行，过0.45 μm微孔滤膜后合并，待HPLC分析[12-15]。

1.3.4 色谱条件 Alltech Apollo C18色谱柱，柱温30 ℃，流动相为醋酸铵缓冲液（pH 5.5）-乙腈（77∶2，V/V），流速1 mL/min，检测波长245 nm，进样量20 μL。醋酸铵缓冲剂与乙腈使用前分别用水膜与有机溶剂膜进行抽滤，过滤后超声20 min去气泡。

2 结果与分析

2.1 玫瑰花多糖的提取

玫瑰干花和玫瑰花渣经2种酶依次提取与非酶法提取的多糖含量与提取率结果见表1。酶法提取优于非酶法，其中玫瑰干花中多糖提取率多2.6 g/100 g，玫瑰花渣中多2.5 g/100 g，可能是由于纤维素酶与果胶酶水解细胞壁，促进细胞中多糖的释放。加酶和不加酶的玫瑰干花中多糖提取量高于玫瑰花渣，可能是由于36 g玫瑰干花是干重，玫瑰花渣是湿重，另外玫瑰花渣是玫瑰花提取精油后的残留物，在提取精油的过程中会有部分损失。

2.2 柱前衍生高效液相色谱分析结果

2.2.1 对照品高效液相色谱图 混合标准品色谱图见图1。由图1可知，在该色谱条件下，甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的保留时间依次为12.0、16.5、17.5、20.0、21.0、28.5、31.0、34.5 min。

2.2.2 玫瑰粗多糖的高效液相色谱分析 采用“1.3.4”条件分析玫瑰多糖，结果见图2。由图2可知，玫瑰多糖是由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖组成的，色谱峰峰高见表2。通过外标法计算得出甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为0.934 4∶0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5。其中酶法与非酶法提取的多糖中单糖组成及含量见表3，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖含量几乎相同。结果表明，加酶和没加酶提取的玫瑰多糖组成成分相同。

3 结论

用酶法提取玫瑰干花、玫瑰花渣的多糖提取率分别为12.487、7.599 g/100 g，普通方法与酶法提取多糖的单糖及糖醛酸组成相同。用柱前衍生高效液相色谱分析了玫瑰多糖的单糖和糖醛酸组成与摩尔比，即甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩尔比为0.934 4∶ 0.981 8∶1.156 6∶0.976 3∶0.974 0∶0.974 5，该结果为开发利用提取玫瑰精油后的残渣资源提供了参考。

参考文献：

[1] PHILIPPIS R D，MAGHERI M C，MATERASSI R，et al. Potential of unicellular cyanobacteria from saline environments as exopolysaccharide producers[J]. Applied and Environment Microbiology，1998，64（3）：1130-1132.

[2] PARIKH A， MADAMWAR D. Partial characterization of extracellular polysaccharides from cyanobacteria[J]. Bioresourse Technology，2006，97（15）：1822-1827.

[3] 孔心渭，孔心冰.野玫瑰根多糖对家兔急性血清病型肾炎肿瘤坏死因子水平的影响[J].佳木斯医学院学报，1996，19（4）：15-16.

[4] 白伟芳. 玫瑰花多糖的提取及其功效研究[D].山东：山东轻工业学院，2010.

[5] 马猛华，于海峰，崔 波，等.玫瑰花渣中多糖的提取研究[J].食品工业科技，2009（11）：218-220.

[6] 陈晓梅，王春兰，王爱荣，等.铁皮石斛原球茎多糖的研究[J].中国药学杂志，2011（20）：1552-1556.

[7] LV Y， YANG X B， ZHAO Y，et al. Separation and quantification of component monosaccharides of the tea polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum by HPLC with indirect UV detection[J]. Food Chemistry，2009，112（3）： 742-746.

[8] GUAN J， LI S P. Discrimination of polysaccharides from traditional Chinese medicines using saccharide mapping-enzymatic digestion followed by chromatographic analysis[J]. Journal of Pharamaceutical and Biomedical Analysis，2010，51（3）：590-598.

[9] 张曰辉，马耀宏，史建国，等. 纤维素酶法提取玫瑰花渣多糖工艺研究[J]. 山东科学，2012， 25（3）：71-74.

[10] 杨 磊，刘晓娟，赵力超，等.果胶酶提取南瓜淀粉的工艺研究[J].农业机械，2012（2）：79-81.

[11] 李雪雁，陈晓前，王玉丽. 果胶酶浸提菊芋菊糖的研究[J]. 食品工业科技，2009，30（11）：223-225.

[12] 郑 岚.液体发酵制备真菌多糖及多糖水解特性研究[D].济南：山东轻工业学院，2011.57-59.

[13] 王泽文，冷凯良，孙伟红，等. 柱前衍生高效液相色谱法分析海带岩藻聚糖的单糖及糖醛酸组成[J].分析科学学报，2011， 27（1）：26-30.

[14] 谭 敏，邱细敏，陆艳艳，等.植物多糖分析方法综述[J].食品科学，2009，30（21）：420-423.

[15] 周 威，张晓燕，段更利. 微波辅助提取-柱前衍生高效液相色谱法分析板蓝根多糖的单糖组成[J].时珍国医国药，2012， 23（1）：236-237.