HPLC测定藏药风毛菊中茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯的含量
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[摘要] 该文建立了hplc同时测定藏药风毛菊中茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯3种香豆素类成分含量的方法。采用Wondasil C18-WR色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），以甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL・min-1；检测波长325 nm；进样量10 μL；柱温35 ℃。结果茵芋苷，东莨菪苷和伞形花内酯在40 min内均达到基线分离，各成分在其线性范围内均呈现良好的线性关系，线性范围分别为0.18～5.6 μg（r=1.000 0），0.060～1.8 μg（r=0.999 9），0.032～0.97 μg（r=0.999 8）。平均加样回收率分别为99.16%（RSD 0.41%），100.3%（RSD 0.79%），102.2%（RSD 0.87%）。该方法操作简便，准确，重复性和稳定性较好，可作为藏药风毛菊的质量评价提供科学依据。
[关键词] 藏药；风毛菊；HPLC；含量测定；质量控制
藏药风毛菊为菊科植物长毛风毛菊Saussurea hieracioides Hook. f.或美丽风毛菊S. pulchra Lipsch. 的干燥地上部分，始载于藏医名著《月王药诊》[1]，为藏族习用药材，具有渗湿利尿，引泻腹水的功效，主要用于水肿，腹水，膀胱炎，小便不利等[2-3]。藏药风毛菊的资源和化学分离方面的研究已有报道，主要含有茵芋苷、东莨菪苷、伞形花内酯、东莨菪内酯等香豆素类成分，以及黄酮类，木质素类等化合物[4-6]。现代药理研究表明，香豆素类成分对淋巴性水肿，肾功能不全所致的肾炎等方面具有较好的效果[7-10]，为藏药风毛菊主要活性成分，但目前还未见有关测定藏药风毛菊中香豆素类成分的报道。据此，本文运用HPLC对不同产地的藏药风毛菊中茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯3种香豆素类成分进行定量分析。
1 材料
Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；CQ-250超声波清洗器（上海必能信超声有限公司）；BP211D电子天平（1/10万，德国Sartorius公司）。伞形花内酯对照品（供含量测定用，批号111739-200501，纯度≥98%）购自中国食品药品检定研究院；茵芋苷对照品（供含量测定用，批号Y-174-120823，纯度≥98%），东莨菪苷对照品（供含量测定用，批号D-062-120831，纯度≥98%）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
共收集了藏药风毛菊样品15批，经成都中医药大学民族医药学院张艺研究员鉴定均为菊科植物长毛风毛菊S. hieracioides的干燥全草，详细信息见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 Wondasil C18-WR色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，0～40 min，20%～30% A；40～45 min，30%～100% A；45～55 min，100% A。流速1.0 mL・min-1；检测波长325 nm；进样量10 μL；柱温35 ℃。在上述色谱条件下3种成分与相邻色谱峰之间得到很好的分离，分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5 000。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备 取茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯对照品适量，精密称定，加80%甲醇溶解制成质量浓度为茵芋苷0.18 g・L-1，东莨菪苷0.06 g・L-1，伞形花内酯0.03 g・L-1的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备 取样品粉末0.5 g，精密称定，置150 mL锥形瓶中，加80%甲醇50 mL，80 ℃回流提取40 min，冷却后称重，补足失重；摇匀，滤过，滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。
2.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶液1，5，10，15，20，25，30 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯峰面积，以各成分色谱峰面积值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X），绘制标准曲线，得回归方程，见表2。
2.5 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，连续进样6次，测得茵芋苷峰面积的RSD为0.63%；东莨菪苷峰面积的RSD为0.65%；伞形花内酯峰面积的RSD为0.51%，说明本法有良好的精密度。
2.6 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h进行测定，进样量10 μL，记录峰面积，计算3种成分的峰面积RSD。结果茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯的RSD分别为0.59%，0.51%，0.47%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验 取同一批样品，按2.3项下供试品溶液制备方法制备5份，分别进样10 μL，按照2.1项下色谱条件测定峰面积，计算茵芋苷，东莨菪苷和伞形花内酯含量的RSD分别为0.55%，1.1%，0.61%，表明供试品溶液的制备方法重复性良好。
2.8 加样回收试验 取已知含量的样品粉末（批号2012091001，茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯质量分数分别为7.858，2.833，4.745 mg・g-1）9份，每份0.25 g，精密称定，分别加入茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯对照品的量相当于样品中各成分含量的80%，100%，120%。按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件依次测定，计算各对照品的平均加样回收率，结果茵芋苷的回收率为99.16%（RSD=0.41%）；东莨菪苷的回收率为100.3%（RSD=0.79%）；伞形花内酯的回收率为102.2%（RSD=0.87%），见表3。
2.9 样品含量测定 取各批次样品粉末，各0.5 g，精密称定，按2.3项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，测定结果见表4。
3 讨论
本研究运用DAD检测器对茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯的对照品溶液进行紫外全波长扫描，发现325 nm波长下供试品中3种成分均具有较好的吸收，干扰少，图谱特征性强，结合文献参考，最终确定测定波长为325 nm。实验对流动相进行了选择，结果0.1%磷酸作流动相时色谱峰峰形较纯水尖锐，基线稳定，分离度好。此外对色谱条件耐用性进行了考察，结果茵芋苷、伞形花内酯和东莨菪苷均得到了较好的分离效果。另比较了2种提取方法（超声和回流），不同提取时间，不同比例的甲醇以及甲醇用量，发现选用80%甲醇50 mL于80 ℃回流提取40 min目标成分效率较高。
本研究所用样品来自四川省阿坝县，若尔盖县，壤塘县，青海省久治县，甘肃省玛曲县，以及自治区拉萨市等产地。通过含量测定表明，藏药风毛菊中香豆素类成分含量普遍较高，这与《晶珠本草》所载藏药风毛菊捣碎进入水中显浅蓝色相符[2]。不同产地的藏药风毛菊中3种香豆素类成分含量存在差异，例如所产药材中茵芋苷，东莨菪苷含量明显大于其他产区，此外，同一地区所产药材各批次间成分含量差异也较大，这些差异可能与产地的气候，海拔，日照等自然因素以及部分区域过度放牧等人为因素影响有关[11-12]。
藏药风毛菊资源丰富，使用广泛，但目前各地使用较为混乱，常以同属多种植物入药使用[13]。此外，藏药风毛菊质量标准仍沿用《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药第一册（1995年版），该标准还未建立藏药风毛菊的相关含量测定指标，不利于药材的质量控制和推广。本实验建立了HPLC同时测定藏药风毛菊中茵芋苷、东莨菪苷和伞形花内酯含量的方法，该方法简便，准确，稳定可靠，有助于藏药风毛菊质量控制水平的提高。
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Determination of skimmin， scopolin and umbelliferone in
Tibetan medicine Saussurea hieracioides by HPLC
TAN Rong WANG Yu-jie ZHANG Yu-xin ZHOU Li-shi TAN Er A Ping ZHANG Yi 1*
（1.College of Ethnic Medicine， Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；
2.Tibet Autonomous Region Institute for Food and Drug Control， Lasa 850000， China）
[Abstract] This study is aimed to establish a high-performance liquid chromatography （HPLC） method for simultaneous determination of skimmin， scopolin and umbelliferone in Saussurea hieracioides. Samples were analyzed on a Wondasil C18-WR column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with methanol （A） and water containing 0.1% phosphate （B） as mobile phases for gradient elution at a flow rate of 1.0 mL・min-1. The detection wavelength and column temperature were set at 325 nm and 35 ℃， respectively， and the sample size was 10 μL. The results showed that skimmin， scopolin and umbelliferone were simultaneously achieved within 40 min under the above conditions. A good linearity was observed in the range of 0.18-5.6 μg （r=1.000 0）， 0.060-1.8 μg （r=0.999 9）， 0.032-0.97 μg （r=0.999 8） for skimmin， scopolin and umbelliferone， respectively， with the average recoveries of 99.16% （RSD=0.41% ）， 100.3% （RSD=0.79%）， 102.2% （RSD=0.87%）. The method is simple， accurate and reproducible and can be used for the quality control of S. hieracioides.
[Key words] Tibetan medicine； Saussurea hieracioides； HPLC； content determination； quality control
doi：10.4268/cjcmm20140620