莲胚性愈伤组织诱导研究初报
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摘要：以鄂藕杂３号莲藕顶芽或侧芽的茎尖为外植体，接种于不同激素配比的ＭＳ培养基上诱导胚性愈伤组织。结果表明，不同浓度的激素组合对莲的胚性愈伤组织诱导有不同的影响，最佳培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ ５．０ ｍｇ／Ｌ。
关键词：莲；茎尖；诱导；胚性愈伤组织
中图分类号：Ｑ８１３．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）14－2991-02
Primary Study on Embryogenic Callus Induced from Shoot Tip of Nelumbo nucifera
ＤＩＡＯ Ｙｉｎｇ１，ＷＵ Ｊｉｎ－ｐｉｎｇ２，ＺＨＡＯ Ｌｉｎｇ－ｌｉｎｇ１，ＨＵ Ｚｈｏｎｇ－ｌｉ１
（１． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７２，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｃｒｏｐ， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： The shoot tips of Nelumbo nucifera “E Ou Za 3” were cultured on medium; and embryogenic callus was induced. The result showed that the induction frequency was affected by the concentration of hormone combinations. The optimal induction medium was MS+0.5 mg/L 6-BA+5 mg/L 2，4-D.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ； ｓｈｏｏｔ ｔｉｐ； ｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ； ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ
莲（Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ Ｇａｅｒｔｎ）属睡莲科多年生草本植物，是我国重要的水生蔬菜。目前莲的种植仍多采用具有两节充分成熟藕身的子藕作藕种进行无性繁殖的方式，该繁殖方式需种量大，扩繁较慢且成本高。目前，已经有多家研究机构报道了莲藕组培快繁研究［１－４］，但是以上研究均是利用诱导丛生苗的方式进行，增殖系数仍然受到一定的限制。鉴于此，特进行了莲胚性愈伤组织诱导试验，为探索快速繁殖藕种的有效方法、降低藕种投入开辟新的途径，同时也为莲的基因工程育种打下基础。
１材料与方法
１．１材料
供试材料采自武汉大学莲藕研究中心基地，取鄂藕杂３号莲藕顶芽或侧芽。
１．２方法
１．２．１愈伤组织诱导用自来水将芽冲洗干净，然后用体积分数为７５％的酒精进行表面消毒１ ｍｉｎ，随即用１ ｇ／Ｌ的ＨｇＣｌ２溶液灭菌８ ｍｉｎ，不时摇动，灭菌完毕后用无菌水冲洗外植体３次。然后在无菌条件下剥取茎尖生长点（约３ ｍｍ），立即接种到固体培养基上，接种插入深度为外植体长度的１／３。诱导培养基以ＭＳ为基本培养基，分别添加６－苄基氨基嘌呤（６－ＢＡ）、２，４－二氯苯氧乙酸钠（２，４－Ｄ）两种植物生长调节剂，其浓度和配比详见表１。蔗糖浓度３０ ｇ／Ｌ，结冷胶（美国Ｓｉｇｍａ公司）２．２ ｇ／Ｌ，ｐＨ值５．８。避光培养。
１．２．２继代培养将诱导出的胚性愈伤组织转入继代培养基，继续培养增殖。继代培养基及培养条件与诱导培养基本相同，只是不再添加活性炭。
１．２．３分化培养将胚性愈伤组织转入分化培养基，诱导分化。分化培养基以ＭＳ为基本培养基，分别添加６－ＢＡ、６－糠基氨基嘌呤（ＫＴ）两种植物生长调节剂，其浓度分别为０．２ ｍｇ／Ｌ和０．５ ｍｇ／Ｌ。蔗糖浓度３０ ｇ／Ｌ，结冷胶２．２ ｇ／Ｌ，ｐＨ值５．８。培养温度（２９±２）℃，每天光照１２ ｈ，光照强度２ ０００ ｌｘ。
２结果与分析
２．１诱导胚性愈伤组织
莲茎尖组织在接种约１０ ｄ后开始膨大，陆续出现愈伤组织。接种后３０ｄ的结果见表１。不同激素组合的培养基中愈伤组织的发生数量、状态和性质均有较大差别。例如，①号组合即低浓度２，４－Ｄ与高浓度６－ＢＡ组合时，仅切口部位发生少量结构紧实的愈伤组织。随着２，４－Ｄ浓度的升高，６－ＢＡ浓度的降低时，愈伤组织发生为淡黄色，质地疏松，表面有许多颗粒状突起，为胚性愈伤组织。但是，当２，４－Ｄ浓度为６．０ ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ浓度为０．４ ｍｇ／Ｌ时，诱导的愈伤组织发白，有空泡化现象出现。由试验结果可知，以ＭＳ＋２，４－Ｄ ５．０ ｍｇ／Ｌ＋６－ＢＡ ０．５ ｍｇ／Ｌ诱导胚性愈伤组织的效果最好（图１）。
２．２继代培养
将胚性愈伤组织转接于继代培养基上进行培养。通过不断继代增殖，其繁殖系数可达１０～１５。每代的培养时间为２８ ｄ，如果超过４０ ｄ，有１０％的愈伤组织出现发白现象，进而水渍状坏死（图２）。
２．３分化培养
胚性愈伤组织转入分化培养基，光照培养１０ ｄ后愈伤组织即开始转绿，２５ ｄ即有明显的芽分化萌出（图３），但是分化成苗率较低，约为１０％。
３讨论
根据前人的经验，试验采用了春夏之交处于旺盛生长状态下的莲芽，并且直接剥取茎尖作为接种材料。在许多材料中，研究者采用生长活跃的组织或器官作为外植体诱导胚性愈伤组织取得了成功，研究中所取的茎尖分生组织有丝分裂极为活跃，是作为莲胚性愈伤组织诱导的良好材料。试验结果表明，这一选择是正确的。同时，采用茎尖培养，也达到了脱毒的效果。
诱导胚性愈伤组织，不同的植物对生长调节剂的要求不同。试验研究表明，２，４－Ｄ和６－ＢＡ的配合才能诱导出莲的胚性愈伤组织。
就目前的结果来看，胚性愈伤组织的诱导率最高也才３２％，还有进一步提升的空间。而且，由于胚性愈伤组织数量的限制，在继代培养基和分化培养基仅选择了一种配方进行培养，尤其是目前分化培养基的成苗率较低，不能满足实际生产的需要，今后需要继续优化和筛选继代培养基和分化培养基的配方。同时，还应该根据前人研究莲丛生
芽生根的培养基配方，设计和筛选适合生根的培养基，从而完善整个莲的胚性愈伤组织诱导及再生体系。
参考文献：
［１］ 曹孜义．实用植物组织培养技术教程［Ｍ］．兰州：甘肃科学技术出版社，１９９８．
［２］ 于文进，龙明华．莲藕组织培养及快速繁殖试验研究［Ｊ］．广西热作科技，１９９７，７（２）：９－１１．
［３］ 彭静，柯卫东，黄新芳．莲藕的组织培养与快速繁殖［Ｊ］．植物生理学通讯，２００１，３７（１）：３８．
［４］ 汤泳萍，罗绍春，占丰溪，等．广昌太空莲组培快繁研究初报［Ｊ］．江西农业学报，２００１，１３（４）：５８－６１．
［５］ 周以飞，潘大仁，林龙云，等． 不同生境型子莲组培苗的快繁研究［Ｊ］． 植物生理学通讯，２００５，４１（２）：１８４．
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