白色链霉菌发酵生产ε—聚赖氨酸工艺的优化

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摘要：采用白色链霉菌N31-69菌株发酵制备ε-聚赖氨酸，考察碳源、氮源等因素对ε-聚赖氨酸产量的影响，优化发酵培养基。结果表明，优化的培养基为葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的浓度分别为30、7、7 g/L，ε-聚赖氨酸摇瓶发酵产量达1.519 g/L，比优化前的产量提高了28.0%。进一步对N31-69菌株在5 L发酵罐内的发酵工艺进行优化，发现发酵48 h后采用流加补糖方式控制还原糖浓度为10～15 g/L，从72 h开始控制pH为4.3，发酵168 h后ε-聚赖氨酸的产量可达15.60 g/L。

关键词：白色链霉菌（Streptomyces albus）；ε-聚赖氨酸；培养基；发酵工艺

中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3635-04

ε-聚赖氨酸由25～30个赖氨酸残基聚合而成，有很强的抑菌能力[1]，被FDA批准为安全的天然生物防腐剂，具有巨大的商业潜力[2]。日本窒素公司已实现ε-聚赖氨酸微生物发酵的工业化生产，发酵罐产量达48.30 g/L[3，4]。而国内ε-聚赖氨酸的研究还处于实验室水平，发酵产量与国外差距很大。刘长江等[5]优化了发酵培养基和培养条件，ε-聚赖氨酸摇瓶产量为1.50 g/L；陈玮玮等[6]对北里孢菌Kitasatospora MY5-36发酵产ε-聚赖氨酸的条件进行优化，摇瓶发酵产量达1.17 g/L，在5 L发酵罐内批式发酵产量达7.72 g/L；黄国昌等[7]在50 L自控式发酵罐中对ε-聚赖氨酸的发酵条件进行研究，发酵产量最高达7.36 g/L。本研究采用白色链霉菌（Streptomyces albus）N31-16菌株发酵制备ε-聚赖氨酸，考察碳源、氮源、无机盐等因素对发酵的影响，以提高ε-聚赖氨酸产量，为促进ε-聚赖氨酸的工业化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

白色链霉菌N31-16菌株，赣南医学院微生物实验室筛选保藏[8]。

1.2 白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸流程

1.2.1 斜面培养 斜面培养基包括酵母浸出粉 4 g/L、麦芽浸出粉 10 g/L、葡萄糖 4 g/L，pH 7.3。接种环取一环平板上单菌落的孢子至斜面，置于30 ℃培养箱中培养4～6 d。

1.2.2 摇瓶种子培养 摇瓶种子培养基为M3G[9]，含有葡萄糖50 g/L、（NH4）2SO4 10 g/L、K2HPO4 0.8 g/L、KH2PO4 1.36 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、ZnSO4·7H2O 0.04 g/L、FeSO4·7H2O 0.03 g/L、酵母浸出粉5 g/L，pH 6.8，装液量为250 mL的三角瓶中装20 mL培养基。接种环取一环斜面孢子，接入种子培养基，在30 ℃、摇床转速220 r/min的条件下培养1 d。

1.2.3 摇瓶发酵培养 摇瓶发酵培养基以M3G培养基为基础，添加不同的碳源、氮源和无机盐，考察其对菌体生长和ε-聚赖氨酸产量的影响，接种量为5%（占发酵液体积比，下同），其他培养条件同摇瓶种子培养。考察某一影响因素时保持其他培养基成分不变，以M3G培养基为对照，其ε-聚赖氨酸相对产量为100%，每处理设置3组平行试验。

1.2.4 发酵罐发酵工艺的优化 接种量3%，加入优化后的发酵培养基，发酵温度30 ℃，转速200～700 r/min，通气速率2～5 m3/min。分别采用3种工艺进行发酵，比较各种工艺对菌体生长和ε-聚赖氨酸产量的影响。①工艺一：发酵液中还原糖浓度降至15 g/L以下后，每隔24 h间歇补糖至25 g/L，pH降至4.3后用氨水控制pH维持在4.3。②工艺二：还原糖浓度降至15 g/L以下后，用流加补糖方式控制发酵液中还原糖浓度为15～20 g/L，pH降至4.3后用氨水控制pH维持在4.3。③工艺三：还原糖浓度降至15 g/L以下后，采用流加补糖方式控制还原糖浓度为10～15 g/L，72 h后用氨水控制pH维持在4.3。

1.2.5 指标测定 ①干重。发酵结束后将发酵液于12 000 r/min离心3 min，弃上清，沉淀洗涤3次，108 ℃下干燥至恒重后称重。②菌体浓度（Packed Mass Volume， PMV）。取10 mL发酵液于4 000 r/min离心10 min，测定上清液体积。PMV=（发酵液总体积-上清液总体积）/发酵液总体积×100%。③残糖含量。采用斐林试剂法测定发酵液中残糖含量。④ε-聚赖氨酸含量。采用优化后的Itzhaki法[4]测定发酵液中ε-聚赖氨酸含量。

2 结果与分析

2.1 摇瓶发酵培养基的优化

2.1.1 碳源对白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的影响 分别选用葡萄糖、土豆淀粉和玉米淀粉作为碳源，每种碳源各取3个水平，共9个处理。不同碳源对白色链霉菌菌体生长和ε-聚赖氨酸产量的影响结果见表1。由表1可知，3种碳源中，葡萄糖为碳源时发酵效果最好，有利于菌株的生长和ε-聚赖氨酸的积累，但过量的葡萄糖对ε-聚赖氨酸的生物合成有明显的抑制作用，可能是由于葡萄糖效应以及渗透压过高引起的。当葡萄糖浓度为30 g/L时ε-聚赖氨酸的相对产量最高，为118.9%。

2.1.2 氮源对白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的影响

1）单一氮源。分别选用（NH4）2SO4、尿素、大豆蛋白胨、酵母浸出粉为氮源，每种氮源各设置3个水平，共12个处理。不同氮源对白色链霉菌菌体生长和ε-聚赖氨酸产量的影响结果见表2。由表2可知，使用单一氮源，ε-聚赖氨酸的产量都很低，其中以（NH4）2SO4作为氮源，发酵液呈酸性，不利于菌体生长，菌体的生物量最低，但ε-聚赖氨酸的相对产量高于其他氮源；以尿素作氮源，发酵液呈碱性，菌体的生物量和ε-聚赖氨酸的相对产量均较低；而以大豆蛋白胨和酵母浸出粉作氮源，发酵液的pH呈弱酸性，有利于菌体生长，菌体生物量较高，但发酵产量很低，可能是发酵液pH偏高，导致ε-聚赖氨酸合成酶的活力低而降解酶的活力高，合成的ε-聚赖氨酸被降解酶分解[10]。因此考虑采用无机氮源（NH4）2SO4和有机氮源复合，同时促进菌体生长和ε-聚赖氨酸的分泌。

2）复合氮源。无机氮源（NH4）2SO4分别与有机氮源大豆蛋白胨和酵母浸出粉组合作为摇瓶发酵培养基的氮源，（NH4）2SO4浓度设置2个水平，大豆蛋白胨和酵母浸出粉各设置3个水平，共12个氮源组合，每处理设置3次平行试验，考察其对白色链霉菌发酵生产ε-聚赖氨酸的影响，结果见表3。由表3可知，与（NH4）2SO4和大豆蛋白胨复合氮源相比，（NH4）2SO4和酵母浸出粉作复合氮源更有利于菌体的生长和ε-聚赖氨酸的积累。其中10 g/L （NH4）2SO4+10 g/L酵母浸出粉作氮源菌体生物量最大，达12.3%，5 g/L （NH4）2SO4+5 g/L酵母浸出粉最有利于ε-聚赖氨酸的积累，相对产量达119.5%，菌体的生长情况也较好，PMV达9.9%。

2.1.3 正交试验结果 根据碳源和氮源优化试验结果，以葡萄糖作碳源，（NH4）2SO4和酵母浸出粉作复合氮源，设计正交试验考察发酵培养基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉浓度对ε-聚赖氨酸产量的影响，因素与水平见表4，结果见表5。由表5可知，培养基中（NH4）2SO4浓度对ε-聚赖氨酸产量的影响最大，其次是葡萄糖浓度，酵母浸出粉浓度的影响最小。最优碳源和氮源组合为A2B2C3，即培养基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的浓度分别为30、7、7 g/L，此条件下ε-聚赖氨酸产量为1.519 g/L，高于其他正交试验组合的结果，比对照M3G培养基提高了28.0%。

2.2 5 L自动发酵罐发酵工艺的优化

在5 L发酵罐内研究N31-69菌株的发酵工艺，一方面放大摇瓶研究的成果，另一方面希望通过工艺的优化进一步提高ε-聚赖氨酸的产量，为工业化生产提供依据。3种不同发酵工艺下菌体的生长和ε-聚赖氨酸的积累情况见表6～表8。由表6可知，工艺一发酵前72 h ε-聚赖氨酸基本无合成，当降低pH后，ε-聚赖氨酸开始慢慢合成。72 h还原糖浓度降至15 g/L以下后，每隔24 h间歇补糖至25 g/L，96 h后菌体生物量开始下降，菌体趋于自溶，发酵168 h时ε-聚赖氨酸产量为2.39 g/L。由表7可知，工艺二用流加补糖方式控制发酵液中还原糖浓度为15～20 g/L，72 h时降低pH后ε-聚赖氨酸迅速累积。120 h后菌体出现自溶，出现自溶时间更晚。发酵168 h 时ε-聚赖氨酸产量为8.75 g/L。由表8可知，48 h后采用流加补糖方式控制还原糖浓度为10～15 g/L，72 h后用10%的氨水控制pH在4.3，菌体生物量在发酵后期一直缓慢增加，未出现明显的菌体自溶现象，发酵168 h时ε-聚赖氨酸产量为15.60 g/L。

综合以上3种发酵工艺，菌体的快速生长期为12～48 h，在此阶段ε-聚赖氨酸基本不合成，降低pH后菌体生长变慢而ε-聚赖氨酸开始大量累积。还原糖浓度的补加方式及浓度对菌体的持续生长和ε-聚赖氨酸的累积有一定影响，采用流加补糖方式更佳，还原糖浓度控制在10～15 g/L最佳，可使菌体持续生长。同时发现在发酵过程中菌丝形态发生较大变化（图1）。在菌体生长期菌丝呈絮状，到产物合成期菌丝开始结球，初期球的核心较松散，外周扩散较大，后期ε-聚赖氨酸大量累积时所形成的菌球越来越致密，球径变小，而当菌体开始自溶时菌球消失，菌丝断裂。菌丝形态变化可能和ε-聚赖氨酸的累积合成有关，有待进一步研究。

3 小结与讨论

本研究通过考察碳源、氮源、无机盐等因素对白色链霉菌N31-69菌株生长和ε-聚赖氨酸产量的影响，对其发酵培养基进行优化。优化后的培养基中葡萄糖、（NH4）2SO4和酵母浸出粉的浓度分别为30、7、7 g/L， ε-聚赖氨酸摇瓶发酵产量达1.519 g/L，比优化前产量提高了28.0%。进一步在5 L发酵罐内对N31-69菌株进行发酵工艺优化，48 h后采用流加补糖方式控制还原糖浓度为10～15 g/L，72 h后用10%的氨水控制pH为4.3，发酵168 h后ε-聚赖氨酸的产量达15.60 g/L。在发酵过程中菌丝形态发生较大变化，可能和ε-聚赖氨酸的累积合成有关，有待进一步研究。

参考文献：

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