Hcy对巨噬细胞胆固醇流出的影响及内质网应激机制的研究
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摘要：目的 探讨同型半胱氨酸 （Homocysteine，hcy）对巨噬细胞胆固醇流出的影响及内质网应激的作用机制。方法 培养THP-1单核细胞源性巨噬细胞后，分别用不同浓度的Hcy（50、100、200、500 M）处理24h，以未加Hcy的细胞作为对照组，以100 M Hcy+叶酸+维生素B12（VB12） 作为干预组。结果 Hcy可以减少巨噬细胞内胆固醇的流出，与对照组相比有统计学意义（P
关键词：同型半胱氨酸；THP-1单核细胞源性巨噬细胞；内质网应激；动脉粥样硬化
动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）是一类以脂代谢异常和炎症反应为主的复杂性病变，其与脂质沉积、炎性细胞浸润、局部血栓形成及氧自由基产生增多有关。本研究以THP-1单核细胞源性的巨噬细胞为研究对象，用不同浓度的Hcy干预后观察胆固醇流出和ox-LDL的含量，并检测ERS相关蛋白的表达，为进一步揭示Hcy在动脉粥样硬化中的作用提供理论基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料 THP-1单核细胞株由本实验室保存；RPMI1640培养基、胎牛血清为Hyclone公司产品；总胆固醇检测试剂盒为北京北化康泰临床试剂有限公司产品；GRP78、CHOP、XBP-1 及ox-LDL检测试剂盒为Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司产品；Hcy、佛波酯（PMA）为Sigma公司产品，其余试剂为国产分析纯[1]。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 取本实验室液氮中冻存的THP-1单核细胞株复苏后，用含15%小牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃、5%CO2孵育箱培养。待细胞融合到80%～90%时，每瓶加入含500nM 佛波酯（PMA）的培养液孵育48h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞。实验分组：①对照组：以不加Hcy巨噬细胞为空白对照组（0 M Hcy）。②实验组：在巨噬细胞中分别以50、100、200、500 M Hcy处理细胞，③干预组：100 M Hcy+叶酸+维生素B12（VB12），各组分别培养24 h后检测后续指标。
1.2.2 TC的测定 采用酶法测定巨噬细胞TC含量，按照试剂盒说明书操作，分别检测各组TC水平。
1.2.3 内质网应激反应蛋白的测定 各组细胞孵育后，收取并裂解细胞，取细胞上清液后，按照ELISA试剂盒说明书测定各组内质网应激反应蛋白（CHOP、XBP-1、GRP78）的含量。
1.2.4 ox-LDL含量的测定 反复冻融细胞，离心后取细胞上清液用ELISA法测定细胞内ox-LDL 的含量，按照ELISA试剂盒说明书依次测量各孔OD值，记录并分析数据。
1.2.5 统计学处理 结果以x±s表示，应用SPSS11.0统计学软件进行统计学分析，两样本均数间比较采用Student's t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，以P
2 结果
2.1 THP-1单核细胞源性巨噬细胞的培养 THP-1单核细胞是悬浮生长的细胞，细胞形态规则、大小均一、胞膜完整（图1A）。经PMA诱导48h后在显微镜下观察显示此时细胞呈贴壁状态，形状不规则并有伪足伸出的巨噬细胞（图1B）。
2.2 Hcy对巨噬细胞内总胆固醇含量变化 不同浓度的Hcy干预人THP-1单核细胞源性巨噬细胞24h后，与对照组相比，各实验组巨噬细胞内胆固醇聚集显著增加，尤其是以100 M Hcy组TC升高最明显，差异有显著性（P
2.3 Hcy 对巨噬细胞内ox-LDL 的影响 与对照组比较，不同浓度Hcy干预后THP-1巨噬细胞内ox-LDL的含量均有所增加，以100 MHcy组最明显，差异有显著性 （P
3 讨论
同型半胱氨酸 （Homocysteine，Hcy）被认为是AS的独立危险因素，其机制与内皮细胞损伤、氧化应激、脂代谢紊乱等有关。不同浓度Hcy干预THP-1源性巨噬细胞后发现，随着Hcy浓度升高，巨噬细胞内TC含量升高，表明Hcy也可以促使巨噬细胞发生泡沫化，推测Hcy抑制了巨噬细胞内胆固醇的流出，使细胞内胆固醇异常增加并导致脂质的堆积，从而介导了泡沫细胞的形成和AS的发生发展。
Hcy不仅影响脂代谢，它本身是蛋氨酸循环过程的中间代谢产物，含有活泼而自由的巯基，容易发生氧化还原反应，产生大量的H2O2和O2-，过量的活性氧使LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL通过增加炎性细胞因子的表达、增强细胞毒性反应、抑制诱导型一氧化氮合酶的产生。本实验探讨了Hcy对巨噬细胞胆固醇流出的影响及内质网应激的作用机制，进一步补充和完善了Hcy引起动脉粥样硬化的机制。
参考文献：
[1]姚树桐，桑慧，杨娜娜，等. 氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞内质网应激及CD36的可能作用[J]， 生理学报， 2010， 62 （5）： 433-440.编辑/王敏