妇科灌肠Ⅱ号对异位子宫内膜细胞核因子κB表达的影响

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摘要：目的观察核因子κB在各种干预条件下在离体培养的人异位子宫内膜细胞中的表达，探讨NF-κB与子宫内膜异位症发生、发展的关系，以及中药妇科灌肠Ⅱ号治疗子宫内膜异位症的疗效机理。方法将第3~7代人子宫内膜间质细胞种植到Transwell 培养板上与Caco-2细胞共培养，并进行干预。通过RT-PCR法检测在各种干预条件下，NF-κB在EM患者内膜细胞中的mRNA表达水平。结果在各种干预条件下，NF-κB mRNA在异位子宫内膜细胞中有不同程度表达，差异有显著性（P＜0.01）。结论核因子κB与子宫内膜异位症有显著关系，中药妇科灌肠Ⅱ号对子宫内膜异位症的疗效机制可能与NF-κB信号通路有关。

关键词：NF-κB；中药；Caco-2细胞模型；子宫内膜异位症

核因子κB（NF-κB）是种能够与多种细胞基因的启动子或增强子特异结合，启动基因转录和蛋白表达的蛋白质。免疫、炎症、细胞凋亡的调节、肿瘤的发生和发展等都会受其调控。目前内异症的发病机制尚不明确，越来越多的研究表明，NF-κB信号途径的活化在EM中起重要作用。很多因素能激活NF-κB信号通路，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是其中重要的一种。TNF-α是由活化的巨噬细胞或肿瘤细胞产生的细胞炎性因子，已有研究表明[1]，TNF-α在EM患者的腹腔液中明显升高，提示TNF-α与EM的发生有一定关系。同时NF-κB信号通路被激活，并呈过度表达状态，参与EM的发生、发展，说明TNF-α介导的NF-κB的活化与EM发生发展密切相关。

为探讨妇科灌肠Ⅱ号治疗子宫内膜异位症的疗效机理，本实验以NF-κB为检测指标，设空白组为对照组，TNF-α组为干预异位子宫内膜细胞、激活NF-κB通路，中药组为验证中药妇科灌肠Ⅱ号的治疗效果，TNF-α+中药组为深入研究中药治疗内异症的作用机理。通过RT-PCR法，检测在各种干预条件下NF-κB在EM患者内膜细胞中的mRNA表达。探讨EM与NF-κB的关系，并对中药妇科灌肠Ⅱ号治疗子宫内膜异位症的机理进行研究。

1资料与方法

1.1一般资料 DMEM/F12培养液（Hyclone），胎牛血清（NQBB），青-链霉素双抗液（Gibco），0.25%胰蛋白酶溶液-EDTA（BIOTOPPED），PBS磷酸盐缓冲液（索来宝）。PCR试剂：Trizol试剂、M-MLV逆转录试剂（Invitrogen），Super Real Pre Mix（北京天根生化科技有限公司）。TNF-α（PROSPEC）。妇科灌肠Ⅱ号冻干粉，天津中医药大学中药研究中心提供。Caco-2细胞株，购于北京协和医院肿瘤所。

1.2仪器 细胞培养箱（Thermo），BCN-1360型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），CKX31型倒置显微镜（Olympus），血球计数板（上海精密仪器仪表有限公司），TranswellR培养板、离心管（Corning），细胞电阻仪（Millipore），高速离心机、移液器，（Eppendorf），荧光定量PCR仪、电泳槽、ChemiDocTM XRS+成像系统（Bio-Rad），制冰机（北京长流科学仪器有限公司），漩涡震荡仪（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3方法

1.3.1干预细胞 Transwell培养板上层种Caco-2细胞，下层种离体培养的人子宫内膜细胞，待细胞贴壁后对其进行干预。实验共分四组，每组3个复孔。空白组：上层加不完全FD培养液0.5mL，下层加不完全FD培养液1mL；TNF-α干预组：上层加不完全FD培养液0.5mL，下层加0.1μg/LTNF-α溶液[2]1 mL；中药组：上层加0.1 mg/mL[3]中药溶液0.5 mL，下层加不完全FD培养液1 mL；TNF-α+中药组，上层加0.1 mg/mL中药溶液0.5 mL，下层加0.1 μg/LTNF-α溶液1 mL。实验后收集所有上清液并分装、标记。PBS冲洗下层子宫内膜间质细胞2遍，冻存-20℃冰箱中，统一检测。

1.3.2 RT-PCR法检测妇科灌肠II号经Caco-2细胞吸收、转运成分，对离体培养的人子宫内膜细胞NF-κB P65的mRNA表达的影响

采用一步抽提法提取细胞mRNA，置于-80℃冻存备用。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录聚合酶链反应，加入3 μg的总RNA，65℃加热5 min，37℃孵育50 min，70℃反应15 min为反应条件，反应所得cDNA模板可立即使用，或-20℃冻存备用。以GAPDH为内参，上游5'GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3'，下游5'CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'，NF-κB为上游5'GTGGGGACTACGACCTGAATG-3'，下游5'GGGGCACGATTGTCAAAGATG-3'，引物均由美国Invitrogen公司合成。PCR反应体系为：2×SuperReal PreMix10 μL，正向引物（10μM）0.2 μL，反向引物（10μM）0.2 μL，cDNA模板1.0μL，RNase-free ddH2O补至20 μL。反应程序为：95℃，10sec，变性；60℃，20sec，退火；72℃，20 sec，延伸；共40个循环。

1.3.3统计学分析 结果以均数±标准差表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理，多组间样本均数的比较采用One way ANOVA法。

2结果

2.1镜下观察各种干预下细胞变化 显微镜下观察各组细胞，TNF-α组与空白组比较，变化不明显，细胞数相对增多一些；中药组可见明显的细胞碎片，但是细胞数仍然很多而且贴壁；TNF-α+中药组与其他组相比，细胞碎片更明显，而且有细胞脱落漂浮，见图1~4。

图1 空白组 图2 中药组

图3 TNF-α组图4 TNF-α+中药组

2.2异位子宫内膜中NF-κB mRNA表达情况，见表1。

各组异位细胞中均有NF-κB mRNA的表达。TNF-α组表达最高，TNF-α+中药组NF-κB mRNA的表达最低。各组与空白组比较有显著差异（P＜0.01），TNF-α组与TNF-α+中药组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

3讨论

妇科灌肠Ⅱ号为韩冰教授根据"活血化瘀，软坚散结"的原则，研制的由丹参、三棱、莪术、乳香、没药、水红花子组成的纯中药制剂，用于子宫内膜异位症的治疗。中药灌肠治疗具有使药效直达病所,避免药物受胃肠酸碱消化液和消化酶的影响,是临床治疗EM较理想的方法之一。为了准确、客观的了解经直肠吸收的中药对EM盆腔病灶的作用，尽量排除干扰因素，本实验将以Caco-2细胞模型作为研究中药经直肠摄取、转运机制的工具，探索中药直肠给药对EM异位病灶生物行为的影响。

Caco-2细胞单层近年来在中药吸收转运研究中被广泛应用。它来源于人类结、直肠，其屏障特性与结、直肠上皮细胞更为相似，因此本实验创新性的将其应用于中药直肠转运、吸收的研究。具体做法是，在Caco-2细胞的对数生长期，将其按8×104/ml密度接种于TranswellR培养板上[4]，在细胞接种19到21天，用细胞电阻仪测定跨上皮细胞电阻，一般为300~500Ω，这时可将子宫内膜间质细胞种在Transwell?培养板上共培养。

本实验通过RT-PCR法，检测TNF-α干扰前后人异位内膜间质细胞NF-κB mRNA表达的变化，得到NF-κB mRNA在TNF-α干扰后表达升高的结论，由此说明有可能是TNF-α对子宫内膜间质细胞的干预激活了NF-κB信号通路。通过观察妇科灌肠Ⅱ号对TNF-α干预的NF-κB信号通路的影响，说明中药妇科灌肠Ⅱ号对NF-κB信号通路可能有抑制作用。

目前我们对参与EM的诸多因素如何相互影响尚不清楚，TNF-α如何诱导NF-κB mRNA表达增加、中药妇科灌肠Ⅱ号如何作用于TNF-α以限制其作用的发挥，均有待深入探讨。

参考文献：

[1]Kyama CM Overbergh L, Debrock S, etal. Increased peritoneal and endometrial gene expression of biological relevant cytokines and growth factors during the menstrual phase in women with endometriosis[J].Fertil Steril,2006,85(6):1667-1675.

[2]王建军,李怀芳,廖小玲.TNF-α对子宫内膜间质细胞VEGF表达的影响[J].生殖与避孕,2007,27(7):450-453.

[3]李沛霖,王盼盼,赵志梅,等.基于Caco-2细胞的中药直肠吸收机制研究[J].天津中医药,2013,30(9):555-556.

[4]杨秀伟,杨晓达,王莹,等.中药化学成分肠吸收研究中Caco-2细胞模型和标准操作规程的建立[J].中西医结合学报,2007,l5(6):634-641.编辑/张燕